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세로토닌 수용체와 환각물질과의 결합구조 규명-환각이나 중독없는 항우울증 후보 탐색에 기여할 것으로 기대

하이거 2020. 10. 21. 14:19

세로토닌 수용체와 환각물질과의 결합구조 규명-환각이나 중독없는 항우울증 후보 탐색에 기여할 것으로 기대

 

등록일 2020.10.16.

 

 


세로토닌 수용체와 환각물질과의 결합구조 규명
환각이나 중독없는 항우울증 후보탐색에 기여할 것으로 기대

□ 기분과 감정을 조절하는 신경전달물질‘세로토닌’의 작용을 매개하는 수용체와 환각물질과의 결합구조가 베일을 벗었다.
○ 세로토닌 수용체 2A를 표적으로 하는 부작용 없는 항우울제 개발연구가 활발한 가운데, 수용체와 환각물질간 결합구조가 밝혀짐에 따라 환각이나 중독을 피할 수 있는 항우울제 설계의 실마리가 될 것으로 기대된다.
* 세로토닌 수용체 2A(5HT2A,Serotonin Receptor 2A) : 14 종류의 세로토닌 수용체중 하나로 뇌의 대뇌피질에서 발견되는 막 단백질이며, 기쁨, 우울과 같은 인간의 기분을 조절한다.

□ 한국연구재단(이사장 노정혜)은 교육부와 한국연구재단이 추진하는 박사후 국외연수지원사업의 지원을 받은 김국래 박사(공동 제1저자)가 소속된 브라이언 로스 교수 연구팀(미국 노스캐롤라이나 대학교)이 세로토닌 수용체와 환각물질(LSD, 25CN-NBOH)과의 결합구조를 규명했다고 밝혔다.
○ 김국래 박사가 공동 제1저자로 참여한 이번 연구의 성과는 국제학술지 ‘셀(Cell)’에 9월 17일 게재되었다.
□ 향정신성의약품으로 지정된 강력한 환각제, LSD와 25CN-NBOH는 대뇌피질에서 주로 발현되는 세로토닌 수용체 2A와 결합하는 것으로 알려져 있었으나 그 결합구조는 알려지지 않았다.

□ 세포막을 관통하며 자리잡고 있는데다 유동적인 특성 때문에 순수하게 분리하기 어려운 세로토닌 수용체 2A의 순수한 단백질 결정샘플을 얻는 것이 급선무였다.
○ 연구팀은 막 단백질을 생성하는데 유리한 곤충세포를 이용했다. 안정적이며 효율이 높은 유전자 전달체를 선별하여 곤충세포에서 발현되도록 함으로써 충분한 양의 수용체 단백질 샘플을 얻을 수 있었다.

□ 얻어진 수용체 결정과 환각물질과의 결합구조는 CryoEM* 과 X-선 결정학*을 이용하여 높은 해상도로 규명하였다.
* CryoEM : 초저온에서 단백질을 얼린 후 전자현미경으로 파티클 이미지들을 얻은 후 단백질 구조를 규명하는 방법
* X-선 결정학 : 단백질의 결정을 X 선 회절을 하여 구조를 규명하는 방법
○ 초저온에서 단백질을 얼린 후 전자현미경 이미지를 얻음으로써 25CN-NBOH와의 결합구조를 얻는 한편
○ 단백질 결정에 대한 X선 회절 이미지를 통해 LSD와의 결합구조를 얻는 데 성공했다.

□ 나아가 이렇게 드러난 결합부위에서 나타나는 독특한 잔기(residue)를 변형시키면 세포 내부로 전달되는 신호가 선택적으로 변하는 것을 통해 활성화 기작을 검증하였다.

□ 향후 인공지능을 이용한 분자설계나 분자도킹을 통해 환각이나 중독 등의 부작용으로부터 자유로운 항우울제 개발을 위한 후보물질을 발굴하는데 실마리가 될 것으로 기대된다.

주요내용 설명

<작성 : 미국 노스캐롤라이나 대학교, 김국래 박사>

논문명
Structure of a Hallucinogen-Activated Gq-Coupled 5-HT2A Serotonin Receptor
저널명
Cell
키워드
세로토닌 수용체, GPCR, LSD, 25CN-NBOH, 구조생물학, CryoEM
DOI
https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.08.024
저 자
브라이언로스 교수(Bryan L. Roth)(교신저자/노스캐롤라이나대), 조저스 스키노이티스 교수 (Georgios Skiniotis)(공동 교신저자/스탠퍼드대), 김국래 박사(제1저자/노스캐롤라이나대), 타오최 박사(Tao Che(공동 제1저자/노스캐롤라이나대), 오울리아나파노바 연구원(Ouliana Panova)(공동 제1저자/스탠퍼드대), 제프리디페토 (Jeffrey F. DiBerto)(참여저자/노스캐롤라이나대), 지안쿤류 박사(Jiankun Lyu)(참여저자/샌프란시스코대), 브라이언크룸 박사(Brian E.Krumm)(참여저자/노스캐롤라이나대), 데니얼워커 교수(DanielWacker)(마운트사나이대), 마이클 로버슨 박사 (Michael J.Robertson)(참여저자/스탠퍼드대), 알패이 스벤 연구원 (Alpay B.Seven)(참여저자/스탠퍼드대), 데이비드니콜스 교수(David E.Nichols)(참여저자/노스캐롤라이나대), 브라이언쇼이켓(Brian K.Shoichet)(참여저자/샌프란시스코대)

1. 연구의 필요성
○ 기존 SSRI*같은 항우울제는 세로토닌 재흡수 저해제로, 세로토닌 수용체가 아닌 SERT*를 표적으로 하고 있어 체내의 모든 세로토닌 재흡수가 억제된다. 이것은 불면, 입마름, 설사, 메슥거림, 식용저하, 불안 그리고 성기능 장애의 부작용이 보고되고 있다.
* SSRI : Selective Serotonin Reuptake Inhibitor
* SERT : Serotonin Reuptake transporter
○ 따라서 인간의 행복과 우울을 관여하는 세로토닌 수용체 2A(5HT2A)를 직접적으로 표적으로 하는 항우울제 개발이 시도되고 있다. 최근 존스홉킨스 대학 연구팀은 마약버섯 추출물인 Psilocybin*에 대한 연구를 진행 중이고 FDA로부터 항우울 혁신 선도연구 약물로 지정받았다.
* Psilocybin : 세로토닌 수용체 2A(5HT2A)의 작용제로 현재 항우울 선도물질로 연구되고 있으며 임상 3상 진행중에 있다.
○ 그리고 5HT2A와 결합하는 LSD, 25CN-NBOH와 결합구조를 알게 되면, 환각이 없는 신약을 개발할 때 중요한 정보가 되므로 이 세로토닌 수용체의 구조규명이 필요하였다.
* LSD, 25CN-NBOH : 향정신성의약품으로 지정된 강력한 환각제
○ 주로 세포막에 존재하는 세로토닌 수용체(5-HTR)는 신경전달물질 세로토닌(5-HT)과 결합하는G단백질결합수용체(GPCR)로, 14개의 아형이 있다. 그 가운데 대뇌피질에서 주로 발현되는 세로토닌 수용체 2A는 기쁨이나 우울 같은 인간의 기분에 영향을 미친다. 환각물질 LSD나 NBOH도 이 수용체와 결합하는 것으로 알려져 있다. 하지만 그 분자적 기전은 잘 알려지지 않았다.

2. 연구내용
○ 세로토닌 수용체(5HT2A)와 LSD 그리고 25CN-NBOH의 결합구조를 규명하기 위해 CryoEM* 과 X-선 결정학*을 이용하였다.
* CryoEM : 초저온에서 단백질을 얼린 후 전자현미경으로 파티클 이미지들을 얻은 후 단백질 구조를 규명하는 방법
* X-선 결정학 : 단백질의 결정을 X 선 회절을 하여 구조를 규명하는 방법
○ 25CN-NBOH와 결합하는 활성화된 수용체의 구조는 CryoEM으로 접근하였다. 먼저 수용체 및 그와 결합하는 G단백질 서브유닛(Gq, Gbeta와 Ggamma)을 모두 순수정제한 후 Titan Krios*장비를 이용, 3.2A의 높은 해상도의 전자현미경 이미지를 얻었고, 그로부터 구조를 규명하였다.
* Titan Krios : Cryo EM을 위해 사용되는 전자현미경의 한 종류
○ LSD와 5HT2A와의 결합구조는 X-선 결정학으로 접근하였다. 막 단백질을 결정화하는 특수한 Lipidic Cubic Phase* 방법으로 수용체 단백질을 결정화하고 APS(The Advanced Photon Source, USA) 방사광가속기연구소에서 X-선 회절데이터를 얻었고, 그로부터 구조를 규명하였다.
* Lipic Cubic Phase (LCP) : 단백질 결정화 방법 중 하나. 주로 막단백질 결정화를 위해, LCP상태에서는 막과 유사한 환경을 만들어주어, 막단백질의 결정화에 도움을 준다.
○ 세로토닌 수용체 2A가 이러한 물질들과 결합하는 부위의 독특한 잔기를변형시킨 후, 단백질 상호간 작용을 검출할 수 있는 BRET* 등을 통해 수용체와의 결합여부를 확인함으로써 활성화 기작을 증명하였다.
* BRET(bioluminescence resonance energy transfer) : 단백질-단백질 결합을 확인하기 위해, 형광단백질을 이용하여 검출하는 방법.
○ 세린242(S242)는 세로토닌 수용체들 중에서 5HT2A만 특이적으로 가진 잔기로서, LSD와 수소결합을 하는 역할을 한다. 이 부분을 알라닌으로 돌연변이 시켰을 때, LSD의 결합력이 감소하는 것을 확인하였으며 이를 통해 왜 LSD가 5HT2A와의 결합력이 강한지에 대한 해답을 얻을 수 있었다.
○ 아이소류신181(I181)은 G 단백질과 소수성 결합을 하는 잔기이다. 이부위의 잔기를 글루타메이트 또는 알라닌으로 돌연변이 시켰을 때, G 단백질의 결합력은 감소하였으나, 어레스틴*의 결합력은 증가하였다. 이 잔기의 변화는 하위의 신호가 선택적으로 변하게 됨을 의미한다.
* 어레스틴(Arrestin) : 인산화된 GPCR과 결합하는 신호 전달 단백질로, GPCR 하위로 신호를 전달하거나, GPCR의 세포내로 이동시키게 하는 역할을 한다.

3. 연구성과/기대효과
○ 이번에 규명된 세로토닌 수용체 구조를 토대로 슈퍼 컴퓨터 또는 인공지능을 이용한 분자도킹을 통해 100만 가지 이상의 화합물 라이브러리를 디자인할 수 있게 되었다. 새로운 항우울제 개발을 위한 후보물질 발굴의 속도를 높이는 데 도움이 될 것으로 기대된다.
* 인공지능을 이용한 분자설계 : AI를 이용하여, 단백질 구조를 기반 그와 결합하는 새로운 약물 후보물질을 설계하고, 예측하는 방법
* 분자 도킹 : 컴퓨터를 이용하여 100 만 가지 이상의 화합물 라이브러리를 통해, 단백질 구조와 결합하는 최적의 화합물을 에너지 계산을 통해 찾아내는 방법
○ 후속연구로 분자 도킹을 이용하여, 초고속 스크리닝을 통해 새로운 항우울 후보물질을 탐색하고자 한다.

그림 설명

 

 


(그림) 세로토닌 수용체와 환각물질(LSD 그리고 25CN-NBOH)과의 결합구조
A.세로토닌 수용체 2A(연두색의 리본구조)와 25CN-NBOH(노란색의 화학구조)의 활성화 상태의 결합구조. 수용체가 활성화된 구조를 관찰할 수 있도록 단백질을 안정화 시키기 위해 G-단백질들 (금색:Gq, 빨강:G-beta, 노랑: G-gamma )을 결합시켰다.
B.세로토닌 수용체 2A(분홍색의 리본구조)와 LSD(진분홍색의 화학구조)의 결합구조

출처 : 노스캐롤라이나 대학교 김국래 박사

연구 이야기

<작성 : 미국 노스캐롤라이나 대학교, 김국래 박사>

□ 연구를 시작한 계기나 배경은?

미국 노스캐롤라이나 대학교 박사후 연구원으로 일하게 되면서 지도교수인 브라이언 로스 교수님으로부터 처음으로 제안 받은 프로젝트입니다. 세로토닌 수용체는 인간의 기분을 조절하고, 또한 환각물질과 직접적으로 결합하여, 신호를 세포내로 전달하기 때문에 매우 중요한 막 단백질인 것을 알았고, 이런 중요한 단백질인 만큼, 꼭 연구에 성공해야겠다 라는 마음가짐으로 시작하게 되었습니다.


□ 연구 전개 과정에 대한 소개

우선 세로토닌 수용체를 곤충세포에서 발현시켜야 했기 때문에, 많은 양의 클로닝(cloning)부터 시작하였습니다. 여러가지 DNA를 제작하고 그 가운데 안정적으로 단백질을 생성할 수 있는 발현율이 가장 좋은 것을 선별했습니다. 그리고 단백질을 순수 분리정제 하였습니다. 세로토닌 수용체가 활성화 상태여야하기 때문에, 수용체와 결합하는 Gq 단백질을 고순도로 정제하였습니다. 정제된 모든 단백질들을 섞어 최종적으로 활성화된 세로토닌 수용체 복합체를 얻을 수 있었습니다.
CryoEM을 이용하여 높은 해상도로 복합체 구조를 규명하였습니다. 그리고 X-선 회절 방법을 통해서도 구조를 규명하였습니다. 최종적으로 LSD 그리고 25CN-NBOH와 세로토닌 수용체의 결합구조를 규명하였습니다. 이 구조를 바탕으로 여러 돌연변이체를 만들었습니다. 그리고 수용체 활성도 측정 실험을 하여 구조적 정보를 뒷받침 하였고, 활성화 메커니즘을 제시할 수 있었습니다.


□ 연구하면서 어려웠던 점이나 장애요소는 무엇인지? 어떻게 극복(해결)하였는지?

세로토닌 수용체는 GPCR 막단백질로 단백질의 물성이 좋지 않습니다. 따라서 세포막과 유사하게 만들어주는 계면활성제(DDM, MNG)를 이용하여 단백질을 안정화 시켰습니다. CryoEM을 위한 그리드(Grid) 제작시 단백질이 얇게 골고루 펴져서 급속히 얼리는 기술이 중요한데, GDN을 이용하여 그 문제를 개선하였습니다. 초기 CryoEM 맵을 토대로 단백질의 잔기들을 하나하나 맞춰야하는데, 해상도가 좋지 않은 부분은 잔기들을 맞추기가 쉽지 않았습니다. 지속적으로 샘플을 준비하여 측정을 하였고, 결과적으로 3.2A의 해상도로 구조를 규명하게 되어, 유의미한 단백질 구조를 얻게 되었습니다.

□ 이번 성과, 무엇이 다른가?

LSD 그리고 25CN-NBOH는 세로토닌 수용체와 결합하여 환각효과를 내는 것으로 알려져 있었지만, 그 분자적 기작에 대하여는 잘 알지 못했습니다. 본 연구에서 수용체와의 직접적인 결합구조를 밝혀냈습니다. 나아가 세로토닌 수용체가 어떻게 활성화되는지 구조적으로 이해할 수 있게 되었습니다.


□ 실용화된다면 어떻게 활용될 수 있나? 실용화를 위한 과제는?

궁극적인 목표는 환각이나 중독, 부작용 우려로부터 자유로운 항우울제의 개발로, 이번 연구는 그 기반을 마련한 것으로 볼 수 있습니다. 세로토닌 수용체의 구조를 바탕으로 인공지능 분자설계나 분자도킹을 통해, 수 만 가지 화합물을 설계할 수 있고, 그 가운데 유력한 후보물질을 도출해 낼 수 있을 것입니다.


□ 꼭 이루고 싶은 목표나 후속 연구계획은?

800개의 G단백질결합수용체(GPCR) 가운데 10%에 못 미치는 70개 정도만 구조가 밝혀져 있습니다. 아직도 알려지지 않은 나머지 90%의 G단백질결합수용체 구조를 밝히고 싶습니다.


□ 기타 특별한 에피소드가 있었다면?

중독이나 환각을 일으킬 가능성이 큰 고농도의 환각물질을 취급하여 실험할 때 늘 주의가 필요했습니다. 항상 실험실 관리자에게 보고하고 실험을 하고, 실험이 끝난 뒤에는 사용량과 남은 양을 점검받아야 했습니다. 실험이 번거로웠지만, 꼭 필요한 과정이기에 끝까지 수행할 수 있었습니다.