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코로나19 바이러스의 신속한 현장 검출을 위한 분자진단 기술 확보-37℃, 30분, 코로나19 변이 바이러스까지 검출 가능성 제시

하이거 2022. 5. 25. 17:12

코로나19 바이러스의 신속한 현장 검출을 위한 분자진단 기술 확보-37, 30, 코로나19 변이 바이러스까지 검출 가능성 제시

등록일2022.04.26.

 

 

 

 

 

 

 

코로나19 바이러스의 신속한 현장 검출을 위한 분자진단 기술 확보

37℃, 30분, 코로나19 변이 바이러스까지 검출 가능성 제시

  

 

□ 코로나19 뿐 아니라 미래의 신종 바이러스까지 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 핵심 기술로 활용 가능한 분자진단 기술이 소개되었다.

 

□ 한국연구재단(이사장 이광복)은 박기수 교수(건국대학교) 연구팀이 등온핵산증폭기술*을 활용해 코로나19 및 변이 바이러스를 한 번에 검출할 수 있는 분자진단 기술을 개발했다고 밝혔다. 

   * 등온핵산증폭기술 : 반복적인 온도조절 과정 없이 등온에서 표적 핵산을 증폭하는 기술 

      

□ 코로나바이러스감염증(COVID-19) 진단은 사스코로나바이러스-2(SARS-CoV-2)의 핵산*을 유전자 증폭기술로 확인하는 분자진단과 항원/항체 반응에 기반하는 면역진단으로 구분할 수 있다. 

   * 핵산 : 생명체의 유전정보를 지니고 있는 필수적인 생체고분자

  ○ 면역 검사법은 검사 비용이 비교적 저렴하고 간편하며 신속한 장점이 있는 반면, 높은 정확도를 보이는 PCR* 기반의 분자진단 방법은 검사 절차가 비교적 복잡하기 때문에 특정 설비를 갖춘 의료기관 등에서만 수행할 수 있다.

   * PCR(polymerase chain reaction, 중합 효소 연쇄반응) : 온도조절과정에 기반한 표적 핵산 증폭기술로, 현재 COVID-19 검출을 위한 표준 분자진단방법임.

  ○ 또한, 시료 채취에서 검사결과를 얻기까지 많은 시간이 소요되기 때문에 즉각적인 대처가 어렵다는 단점이 있다.

 

□ 이에 연구진은 변이 바이러스를 포함한 코로나바이러스, 박테리아 등을 37도(℃)에서 30분 만에 신속 진단할 수 있는 ‘신규 등온핵산증폭기술(STAR)*’을 개발했다. 

    * 신규 등온핵산증폭기술(STAR) : split T7 promoter-based isothermal transcription amplification with light-up RNA aptamer 로 명명

  ○ 개발한 기술은 바이러스의 유무뿐만 아니라 종류 구분도 가능하며, 기존 PCR 및 등온핵산증폭기술 기반 분자진단 방법과 달리, 반응 개시 전 온도조절 과정이 필요 없고 하나의 효소(T7 RNA 중합효소)만을 이용, 37도의 일정한 온도에서 반응이 진행되는 특징이 있다.

  ○ 전남대학교병원 최현정 교수 연구팀을 통해 확보된 60여명의 실제 임상 샘플을 적용한 결과, 코로나19에 대해 높은 민감도(96.7%)와 특이도(100%)를 보임을 확인하였으며,

  ○ 바이러스, 박테리아 및 암 등 다양한 핵산 바이오 마커 검출 시 활용 가능할 것으로 내다봤다.

 

□ 연구팀은 STAR 개발을 통해 유전자 진단 분야에서 시간 및 비용을 절감할 수 있는 방안을 제시하였으며, PCR로 대표되는 현재의 유전자 분석 기술을 대체할 수 있는 대안 기술로의 활용 가능성을 기대했다.

 ○ 다만, 현장에서 손쉽게 결과를 확인할 수 있는 시스템 구현을 위해 추가연구가 필요하며, 기술의 확장성 검증을 위해 다양한 핵산 바이오 마커 검출 연구가 지속적으로 이루어져야 한다는 설명이다.

 

□ 과학기술정보통신부와 한국연구재단이 추진하는 우수신진연구사업의 지원으로 수행된 이번 연구의 성과는 바이오센서 분야 국제학술지 ‘바이오센서스 앤드 바이오일렉트로닉스(Biosensors and Bioelectronics)’에 3월 31일 온라인 게재되었다. 

 

주요내용 설명

 

  <작성 : 건국대학교 박기수 부교수>

 

논문명

Split T7 promoter-based isothermal transcription amplification for one-step fluorescence detection of SARS-CoV-2 and emerging variants

저널명 

Biosensors and Bioelectronics

키워드 

COVID19(코로나19), Isothermal amplification(등온증폭), Split T7 promoter(분할 T7 프로모터), Three-way junction(3-방향접합), Transcription(전사)

DOI

doi.org/10.1016/j.bios.2022.114221

저  자

박기수 교수(교신저자/건국대학교), 윤태휘 석사(제1저자/건국대학교), 신지예 석사(제1저자/건국대학교), 최현정 교수(교신저자/전남대병원)

 

 

1. 연구의 필요성

○ 2020년 3월 11일 세계 보건기구(WHO)에서 pandemic으로 선포된 COVID-19은, 2019년 12월 처음으로 중국 우한에서 보고된 이후 2022년 3월 기준으로, 전 세계 국가에서 총 4억 8,100만명 이상의 사람들을 감염시키고 610만명 이상의 사망자를 발생시켰으며 전 세계에 심각한 경제적 손실과 사회적 부담을 초래할 뿐 아니라 인류 삶의 질을 현저히 떨어뜨리고 있는 인류 역사상 최악의 재앙으로 판단되고 있음.

○ 이러한 재앙적인 상황을 최소화하기 위해서는 COVID-19의 신속한 조기진단을 통해서 COVID-19 바이러스의 추가감염 및 확산을 막는 것이 유일한 해결책으로 평가되고 있음. 

○ COVID-19의 진단은, 크게 SARS-CoV-2 바이러스 핵산(viral nucleic acid)의 유전자 증폭에 기반하는 분자진단과 항원/항체 반응에 기반하는 면역진단으로 구분할 수 있음. 면역진단은, 검체 내에 포함되어 있는 항원 바이러스를 직접 검출하는 항원진단(viral antigenic test)과, 감염된 사람의 혈청에 존재하는 항체를 검출하는 혈청 면역검사(serological test)로 구분할 수 있음. 이러한 면역 검사법은 매우 간편하고 신속하며 (혈청 검사의 경우 10분, 항원검사의 경우 15분 이내) 또한 비용이 비교적 저렴하다는 큰 장점을 가지고 있으나, 핵산을 검출하는 분자진단에 비해서 면역반응을 통한 검사는, 진단의 정확도가 낮을 뿐만 아니라, 감염된 사람의 혈청에서 IgM과 IgG 항체의 유무를 검출하는 혈청 면역검사의 경우, 감염 초기에는 (1~3일) 정확한 진단이 불가능하다는 단점이 있음. 이러한 문제점 때문에, 우리나라를 비롯한 많은 나라에서 COVID-19 진단의 표준방법(Gold standard)으로 핵산 증폭[RT-PCR(Reverse Transcription-PCR)]을 통한 분자진단을 널리 채택하고 시행하고 있음. 

○ RT-PCR 기반 분자진단 방법은 면역진단에 비해서 높은 정확도를 보이는 반면, 검사 절차가 비교적 복잡하기 때문에 특정한 전문 설비를 갖춘 대형병원이나 의료기관에서만 수행할 수 있다는 단점이 있음. 또한, 시료채취에서 검사결과를 얻기까지 비교적 많은 시간이 소요되기 때문에 즉각적인 대처가 힘들다는 단점을 가지고 있음. 

 

2. 연구내용 

○ 코로나19 바이러스(변이 바이러스)를 포함하여 박테리아를 37도, 30분의 반응을 통해 신속하게 진단할 수 있는 신규 등온핵산증폭기술(STAR[split T7 promoter-based isothermal transcription amplification with light-up RNA aptamer]로 명명함)을 개발함. 

○ 분할된 T7 프로모터(Split T7 promoter)를 설계하여, 하나의 효소(T7 RNA polymerase)를 사용, 37도, 30분 반응을 통하여 타겟 유전자 마커를 고감도, 고특이도로 검출할 수 있는 3-방향접합(Three-way junction) 구조 기반의 등온핵산증폭기술을 개발함.

○ 개발 기술은 60명의 실제 임상샘플에서 높은 민감도, 특이도를 보임을 검증하였으며, SARS-CoV-2 바이러스 뿐만 아니라 다양한 변이 바이러스 및 박테리아의 검출로 활용이 가능함을 증명함.

○ 보유기술의 차별성 및 기존 기술과의 비교 우위성

 1) 소형화, 현장진단 시스템의 구현: 기존의 실시간 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)은 온도조절(thermocycling)이 필수적으로 필요 하기 때문에, 소형화 장치 및 현장진단 시스템의 구현이 어려움. 반면 제안하는 전사 반응 기반의 등온핵산증폭기술은 37도의 온도에서 30분간의 반응을 통하여 증폭/검출이 이루어짐. 

 2) 응용 가능성이 큰 등온핵산증폭기술 구현: 다양한 효소(strand displacement polymerase 및 nicking endonuclease)를 이용한 등온핵산증폭 기술들이 개발되고 있으나, 대부분 반응 개시 전의 온도 조절을 통한 변성(denaturation)/어닐링(annealing) 단계가 필요하며, 최소 2개 이상의 효소가 필요하기 때문에 반응 최적화가 어렵고 검출 단계가 복잡함. 반면 제안하는 등온핵산증폭기술은 반응 개시 전의 온도 조절이 필요 없고, 하나의 효소(T7 RNA polymerase)를 이용하여 반응이 진행됨.

 3) RNA를 cDNA로 변환하는 과정 없이 바로 분석이 가능: 3-방향 접합 구조에 기반을 두고 있기 때문에 RNA를 cDNA로 변환하는 과정 없이 바로 분석할 수 있으며, 이를 통해 오염(contamination)과 위양성(false positive) 문제없이 고감도 검출 시스템의 구현이 가능함. 또한, 바이러스, 박테리아 등의 다양한 핵산 바이오 마커의 검출로의 응용/확장이 용이함.

 4) 복잡한 핵산 추출과정 없이 분석 진행: 박테리아 및 바이러스의 열 분해(thermal lysis) 후에 바로 분석이 진행되는 Direct 검출 기술과의 접목을 통하여 현장에서 신속한 분석을 위해 활용이 가능함.

 

3. 연구성과/기대효과

○ 본 연구팀이 개발한 기술은 37도에서, 30분의 반응을 통해 다량의 RNA 증폭산물을 생성하는 효율적인 유전자 증폭법으로서, 코로나19 및 관련 변이 바이러스를 한 번에 검출해낼 수 있으며, 저렴하고, 소형화 현장 시스템의 구현이 용이한 기술임.

○ 2023년에는 글로벌 분자진단시장이 약 220.3억 달러 규모에 이를 것으로 전망되는 상황에서 국내의 독자적인 기술로 개발된 제품으로 막대한 경제적 파급효과를 가져올 수 있으며, 국제적 경쟁력을 크게 높일 수 있음.

○ 핵심기술을 바탕으로 COVID-19 바이러스 뿐만 아니라 미래에 출연하게 될 새로운 바이러스, 박테리아 및 암(cancer)에 신속하게 대응할 수 있는 원천기술로도 활용될 수 있음.

 

그림 설명

 

 

 

 

(그림1) 코로나19 및 변이 바이러스의 신속 검출을 위한 신규 등온핵산증폭기술의 모식도

코로나19 및 변이 바이러스가 존재할 경우, 바이러스의 유전물질(RNA)은 DNA 프로브의 3-방향 접합(three-way juction)구조를 형성하고, T7 RNA 중합효소에 의한 전사반응을 진행함. 결과적으로 많은 양의 RNA 압타머가 생성되고, 이는 형광 염료와 결합하여 향상된 형광 신호를 발생하게 됨. 하나의 효소(T7 RNA 중합효소)를 이용하여 37도, 30분 반응을 통하여 타겟 유전자 마커의 분석을 완료할 수 있으며, 추가적인 표지과정 없이 저렴하고 손쉽게 DNA 프로브를 디자인하여 코로나19 및 변이 바이러스의 다중분석(multiplex analysis)이 가능함. 

 

그림설명 및 그림제공 : 건국대학교 박기수 부교수 

 

 

 

 

 

(그림2) 개발 기술의 유효성 검증을 위한 실제 임상샘플 분석 결과 

코로나19에 감염된 환자 30명, 정상인 30명의 RNA 샘플을 이용하여 개발 기술의 유효성을 검증한 결과이며, 민감도 96.7%, 특이도 100%를 달성함. 또한, 통계분석(Two-tailed Student’s t-test)을 통하여 양성, 음성 샘플을 완전하게 판별 할 수 있었음(P < 0.0001). 본 결과는 코로나19 진단의 표준방법인 RT-PCR 방법과 일치함을 확인함 (R=8393).

 

그림설명 및 그림제공: 건국대학교 박기수 부교수 

 

 

 

 

 

연구 이야기

 

                     <작성 : 건국대학교 박기수 부교수>

□ 연구를 시작한 계기나 배경은?

 

- 2021년도에 암 진단을 위한 등온핵산증폭 기반 핵산 바이오 마커의 고감도, 다중 분석기술을 개발한 후(doi.org/10.1016/j.snb.2020.129410), 기존에 진행된 등온핵산증폭기술의 문제점/한계점에 대해서 상세히 파악할 수 있었습니다. 무엇보다 등온핵산증폭과정에서 사용되는 DNA 프로브와 효소 종류가 많아지면, 비특이적인 반응이 진행될 가능성이 높은 것을 확인할 수 있었습니다. 

- 이에 기존 기술의 문제점을 해결하고, 실제 현장에서 활용될 수 있는 등온핵산증폭기술을 개발하고자 본 연구를 시작하게 되었으며, 2020년부터 전 세계에 심각한 경제적 손실과 사회적 부담을 초래하고 있는 코로나19를 검출 타겟으로 설정하고 연구를 진행하게 되었습니다. 

 

 

□ 연구 전개 과정에 대한 소개

 

- 기존의 등온핵산증폭 방법이 무엇이 있는지에 대한 조사와 경험을 기반으로 검출을 위한 핵산증폭반응은 최대한 간편하게 진행되어야 하며 반응을 진행하는 효소의 개수가 최소화되어야 한다는 것을 기본 전제조건으로 잡았습니다. 

- RNA를 검출할 시 대부분의 핵산증폭기술은 cDNA로의 전환이 필요하며 이 과정에서 효소 한 개가 추가적으로 사용되는데, 이를 보완하고자 RNA를 직접 검출할 수 있는 Three-way junction(3-방향 접합) 구조를 도입하여 추가적인 효소의 첨가 없이 RNA의 직접적인 검출을 진행하였습니다.

- 전사반응을 기반으로 하는 대부분의 검출 방법은 T7 promoter라는 특정 dsDNA 영역을 만들어주어야 하는데 이 과정에서 추가적인 DNA 중합효소가 사용되게 됩니다. 이를 해결하고자 T7 promoter의 영역이 조건부로 활성화되게끔 조절하였습니다. 이를 통해 DNA 중합효소의 도움 없이 타겟 RNA 물질이 존재할 때만 활성화되고, 타겟 RNA 물질이 없을 때는 활성화되지 않게 하여 추가적인 효소의 첨가 없이 검출 시스템을 구현하였습니다.

- 결과적으로 DNA probe만을 사용하여 3-방향 접합 구조를 이루게 하는 고특이적인 방식으로 SARS-CoV-2 바이러스 뿐만 아니라 다양한 변이 바이러스 및 박테리아의 검출로 활용이 가능함을 입증하였습니다.

 

 

□ 연구하면서 어려웠던 점이나 장애요소는 무엇인지? 어떻게 극복(해결)하였는지?

 

- 검출 시스템의 민감도를 향상시키기 위해서는 반응의 지수 증폭이 되어야 합니다. 이를 위해서는 표적 물질이 재사용 되거나 생성되는 반응이어야 하는데 개발하던 시스템에서는 그러한 반응을 유도해내기 쉽지 않았습니다. 이를 해결하고자 표적 RNA가 길다는 점을 활용하여, RNA의 서로 다른 위치를 표적하였고, 결과적으로 하나의 RNA 물질에서 여러 증폭 반응을 이끌어 낼 수 있었고, 민감도를 증대시켰습니다.

 

 

□ 이번 성과, 무엇이 다른가? 

 

- 개발된 기술은 코로나19를 포함한 핵산 바이오 마커의 검출을 위한 표준방법인 PCR 방법의 온도 조절 과정을 필요로 하지 않고, 등온(37도)에서 30분의 반응을 통해 증폭이 이루어지고 결과를 얻을 수 있습니다. 결과적으로, 소형화 시스템의 구현이 용이하고 현장에서의 사용이 가능합니다. 

- 기존 PCR 기술의 경우, RNA를 cDNA로 전환하는 과정 후에 증폭이 진행되기 때문에, DNA에 의한 교차오염 가능성이 높으며, 이로 인한 위양성(false positive)가능성이 높다는 문제가 있었습니다. 반면 본 기술은 RNA를 바로 인식하여 증폭이 이루어지기 때문에, 기존의 문제점을 극복할 수 있으며, 정확한 분석이 가능합니다. 

- 기존에 개발된 다양한 등온핵산증폭기술과 비교하여 본 기술은 구동에 필요한 실험요소들이 간단하여, 핵산 바이오마커를 인식할 수 있는 DNA 프로브와 T7 RNA 중합효소만을 이용하여 한번에 핵산 바이오마커를 분석할 수 있다는 장점이 있습니다. 

- 복잡한 핵산 추출 과정 없이 박테리아와 바이러스의 열 분해 후에 바로 분석이 가능하다는 장점을 가지고 있습니다.  

- 이러한 우수성을 바탕으로 다양한 핵산 바이오 마커의 진단을 위한 핵심 원천 기술로 활용이 가능합니다.

 

 

□ 실용화된다면 어떻게 활용될 수 있나? 실용화를 위한 과제는?

 

- 분자진단키트로 제품화하여, 공항 및 항만과 같이 대량의 샘플 분석이 필요한 분야와 개인병원 및 개인이 집에서 자가 진단을 진행하는 분야에 활용이 가능합니다. 

- 핵산분석 기술에 기반을 두고 있기 때문에, 바이러스 뿐만 아니라 박테리아, 암의 진단으로 활용이 가능합니다.

- 기존 분자진단 기술의 단점을 극복할 수 있는 본 기술의 우수성을 바탕으로 실용화 가능성이 높다고 판단되며, 다양한 질병으로 확장 가능성을 검증하고, 대량생산을 위한 분자진단키트 제작이 진행될 필요가 있다고 생각합니다.

- 감염 초기에 소량 존재하는 핵산 바이오 마커의 검출을 위하여 개발 기술의 민감도를 추가적으로 향상시킬 필요가 있으며, 달성 시 실용화를 통한 기대효과는 클 것으로 예상됩니다.

 

 

□ 꼭 이루고 싶은 목표나 후속 연구계획은? 

 

- 실험실에서 개발된 기술을 실제 산업 현장에서 활용될 수 있도록 제품화하고 실용화하는 것을 목표로 하고 있습니다. 

- 질병의 조기 진단을 위하여, 초고감도 검출 시스템을 구축할 계획이며, 다양한 질병으로의 확장 가능성을 검증하고자 합니다.

 

 

□ 기타 특별한 에피소드가 있었다면?

 

- 개발 기술의 유효성 검증을 위하여 실제 임상샘플 테스트를 계획하였으나, 샘플 확보에 어려움이 있었습니다. 미국 박사 후 과정의 지도교수이신 하버드의대의 이학호 교수님 소개로 전남대병원의 최현정 교수님과 연결될 수 있었고, 최현정 교수님의 큰 도움으로 본 연구를 잘 마무리 지을 수 있었습니다.