장내미생물 연구를 위한 고기능 ‘장기 유사체’ 개발

장내미생물 연구를 위한 고기능 ‘장기 유사체’ 개발

 

구분 : 연구성과작성자 : 관리자작성일 : 2020-08-12

장내미생물 연구를 위한 고기능 ‘장기 유사체’ 개발
- 고성능 3차원 장 오가노이드를 이용한 장내미생물 연구모델 개발로 기존 숙주-장내미생물 연구모델의 한계 극복
- 장내미생물과 인간의 상호작용ㆍ작용기전 이해 등 다양한 융합기술 영역에서 활용 기대

□ 한국생명공학연구원(원장 김장성, 이하 생명硏)은 인간 전분화능 줄기세포로부터 분화된 3차원 장 오가노이드에 체외성숙화 기술을 적용하여, 진보된 형태의 숙주-공생미생물 간의 상호작용 연구모델을 세계 최초로 보고하였다. 금번 성과는 장내미생물 연구를 위한 세포 모델의 수준을 한 단계 높인 것으로서, 기존 장세포 모델의 세포 다양성 및 기능성 부족 문제를 해결한 최초의 성과이다.
ㅇ 생명硏 줄기세포연구센터 손미영 박사팀, 생물자원센터 박두상 박사팀 과 한국과학기술연구원 생체재료연구단 김상헌 박사팀(교신저자 : 손미영/박두상/김상헌 박사, 제1저자 : 손예슬 UST 통합 4년차)의 공동연구로 수행한 이번 연구는 과학기술정보통신부와 한국연구재단의 대한민국 바이오 위대한 도전(Korea Bio Grand Challenge) 사업, 농촌진흥청사업 및 생명硏 주요사업의 지원으로 수행되었고, 생물학 분야의 권위지인 파셉 저널(the FASEB journal) 6월 30일자 온라인 판에 게재되었다.
(논문명: Maturation of human intestinal organoids in vitro facilitates colonization by commensal lactobacilli by reinforcing the mucus layer)
□ 연구팀은 3차원 인간 전분화능줄기세포 유래 장 오가노이드에 체외성숙화 기술을 도입하여 장내미생물 생착에 유리한 미세 환경을 갖춘 숙주-장내미생물 상호작용 연구모델을 제작하였다.
ㅇ 이러한 체외성숙화 장 오가노이드는 장내미생물이 장 상피에 부착/증식하기 위해서 필수적인 것으로 알려진 뮤신(mucin)을 분비하는 기능성 배상세포(goblet cell)를 포함하고 있으며, 이를 통해 뮤신층(mucus layer)을 형성하고, 장벽 기능(barrier function)이 증가되어 있다. 그 결과 인간의 장과 유사한 환경을 조성하여 기존 장 오가노이드의 장내미생물 연구 모델로서 한계점을 극복하였다.
* 배상세포(goblet cell) - 점막에 섞여있는 점액 분비 세포
ㅇ 실제 유용 프로바이오틱스(probiotics, 유산균)로 알려진 락토바실러스를 미세주입하여 생착이 증가함을 확인함으로써, 체외성숙 장 오가노이드의 장내미생물 연구모델로서의 유용성을 증명하였다.
□ 본 연구는 인간 전분화능줄기세포 유래 체외성숙 장 오가노이드 기반 락토바실러스 연구모델을 세계 최초로 보고하였으며, 이는 장내미생물 연구 플랫폼으로서 장 오가노이드의 실용화 기반을 구축했다는데 의의가 있다.
□ 줄기세포연구센터 손미영 박사는 “오가노이드 연구분야의 가장 큰 목표는 성인을 모사하는 수준 높은 고기능 인간 오가노이드를, 다양한 연구를 위한 테스트-베드(test-bed)로써 제공하는 것이며, 특히 바이오 분야의 차세대 성장 동력으로 주목받고 있는 ‘마이크로바이옴’ 기반 치료제 연구 및 작용기전 연구에 혁신적으로 활용될 수 있다.”며,
□ “본 연구팀의 체외성숙화 장 오가노이드는 장내미생물의 생착과 증식이 가능한 최고 수준의 장내미생물 연구 모델로서 장내미생물과의 상호작용ㆍ기전 연구를 진행하고 있으며, 최근에는 ‘마이크로바이옴’ 조절 기전을 통한 질환 치료제 연구 등 다양한 융합영역에서 본 연구팀의 오가노이드를 이용한 연구를 진행하고 있다.”고 밝혔다.

연 구 결 과 개 요

□ 연구배경
○ 인체에서 상호 작용하는 미생물들의 총체적인 유전 정보를 뜻하는 마이크로바이옴은 ‘제2의 장기(forgotten organ)’로 일컬어질 만큼 인간의 건강 및 질병에 밀접하게 연관되어 있으며 중요 난치질환에 대한 새로운 대안으로 제시되고 있다. 이에 따라, 전 세계적으로 집중적인 연구 투자가 이루어지고 있으며, 과거의 개별 미생물 분석연구에서 나아가 인간, 동ㆍ식물 등 숙주와의 상호작용 연구로 그 범위가 점차 확대되고 있다.
○ 인체마이크로바이옴을 구성하는 미생물의 70%가 소화기관에 밀집해 있으며, 최근 마이크로바이옴 기반 의약품 연구와 제품 개발이 활발히 이루어짐에도 불구하고 여전히 인간-마이크로바이옴 특히, ‘소화기관-장내미생물’ 간의 이해를 위한 연구 모델은 부족한 실정이다.
○ 현재까지 장내미생물 연구는 실험동물 모델, 2차원 배양 세포(암세포주, primary cell 등)가 주로 활용되어왔으나, 인간과의 생리ㆍ병리학적 특성의 차이와 인체 복잡성 모사의 한계로 인해 진보된 장내미생물 연구를 위한 세포모델 개발이 필수적이다.
○ 줄기세포 분화기술의 발전으로 3차원 배양기술 기반 ‘장 오가노이드’ 제작이 가능해졌으며, 2015년부터 전 세계 많은 연구진들이 기존의 장 오가노이드를 활용하여 병원성미생물(salmonella, Clostridium difficile, Escherichia coli 등)과의 숙주-병원성미생물 상호작용에 대한 연구사례가 있으나, 공생미생물과의 상호작용 연구는 많이 부족한 실정이다.
○ 락토바실러스는 탄수화물을 젖산으로 분해하는 유산균으로, 사람의 장 전반에 걸쳐 고르게 분포하고 있으며, 소장에 높은 비율로 존재하며, 모체로부터 다양한 형태(출산, 모유수유 등)로 신생아 소장에 정착하여 장 발달과 건강에 도움을 주는 것으로 알려져 있으나, 인체 적용을 위해서는 정확한 작용기전에 대한 심도있는 연구가 필수적이다.
○ 그러나, 조직 특이적인 세포로 구성되어 있는 기존의 장 오가노이드는 2차원 세포 모델에 비해 인체 유사도가 높다고 평가되고 있지만, 기존 분화기술로 제작된 전분화능 줄기세포 유래 장 오가노이드는 태아 수준의 기능성을 가지기 때문에 보다 정확한 장내미생물 연구 플랫폼으로 활용하기 위해서는 인체 유사도 증진 및 고기능성 확보가 필수적으로 요구되었다.

○ 2011년 Nature에 Jason R. Spence 연구팀에서 보고한 인간 전분화능 줄기세포 유래 장 오가노이드 분화기술은 세포 복잡성(complexity), 조직의 구조(structure) 그리고 생리학적(physiology) 특성을 모사하고 있지만, 미성숙한 태아 소장의 특성을 반영하는 모델로 실제 성인의 장을 모사하기에는 제한이 있다
○ 본 연구팀에서는 2018년 소장 오가노이드의 체외 성숙화 기술을 Nature Communications에 최초 보고하였다. 해당 연구는 면역세포 유래 규명인자인 인터루킨-2(interleudin-2, IL-2)를 통해 장 오가노이드의 기능성 향상 및 성인 소장과의 유사도 증진을 보고한 사례이다. 체외 성숙 장 오가노이드는 실제 활용 가능한 높은 수준의 기능성을 보유하고 있기 때문에 특히, 기존 연구모델과 상호보완을 통해 진보된 형태의 장내미생물 연구모델로서 활용될 수 있을 것이다.

□ 연구내용
○ 본 연구팀은 기존 분화기법을 활용하여 전분화능 줄기세포 유래 장 오가노이드를 제작하였고, 소장을 구성하는 4대 세포인 배상세포(goblet cell), 흡수세포(enterocyte), 파네스 세포(Paneth cell), 내분비세포(enteroendocrine cell)의 존재를 확인하였다.
○ 락토바실러스는 통성혐기성 균주로서 미생물배지(MRS)에서 배양이 가능하다. 락토바실러스를 각각 MRS배지와 오가노이드 배양배지에서 혐기/호기성 조건에서 배양하였을 때, MRS 배양배지에서는 증식이 되는 반면, 오가노이드 배지에서는 증식되지 않음을 확인할 수 있었다. 본 연구팀은 미세주입(microinjection) 기술을 활용하여 L. rhamnosus와 L. reuteri를 장 오가노이드 내부에 주입 하여 12시간 동안 배양 후 도말하여 생균수(colony forming unit, CFU)를 측정 하는 방법으로 미생물의 주입 직후부터 배양 12시간까지 미생물이 오가노이드 내부에서 생존상태로 유지되고 있음을 관찰하였다.
○ 실제 소장에서 미생물의 부착 및 증식에는 장세포에서 분비하는 뮤신(mucin)층이 중요하게 작용하는 것으로 알려져 있으며, 이는 미성숙 장관과 성숙된 장관의 큰 차이점이기도 하다. 본 연구팀은 기존에 개발한 체외성숙화 기술을 적용하여 장 오가노이드 구성세포의 기능성을 증진시키고자 하였고, 면역세포 유래 성숙화 유도 인자인 인터루킨-2 (interleukin-2, IL-2)를 처리하여 배양 시 다양한 성숙화 마커의 발현이 증가되었음을 확인하였다. 더불어 뮤신을 발현하는 세포인 배상세포(goblet cell)의 기능과 밀접한 연관성을 가진 뮤신 패밀리 유전자와 glycoprotein-연관 유전자 발현이 증가, 뮤신층의 증가, 배상세포 수의 증가를 확인하였고, 이는 성인의 소장과 유사한 수준임을 검증하였다.
○ 소장 상피세포 간 결합을 담당하는 밀착연접(tight junction)은 소장 상피의 장벽 기능(barrier function) 유지와 세포의 극성(polarity)에 중요하게 작용한다. 주사전자현미경(scanning electron microscopy, SEM)을 이용하여 성숙 장오가노이드를 관찰하였을 때, 미성숙 오가노이드에 비하여 정렬된 형태의 미세융모(microvilli)가 높은 밀도로 형성되었으며, 단위면적 당 많은 수의 융모(villi)를 관찰되었고, 세포의 밀착연접(tight junction) 마커의 발현 또한 성인 소장 수준으로 증가되어 세포 장벽 기능을 가지고 있음을 확인하였다.
○ 뮤신층과 소장 상피의 막 기능이 향상된 체외 성숙 장 오가노이드와 기존 장 오가노이드 내강(lumen) 위치에 L. reuteri 균주를 미세주입하여 생균수를 측정한 결과, 미성숙 장 오가노이드에 비해 성숙 장 오가노이드에서 L. reuteri는 미세주입 초기 세포 수 보다 동일한 시간 내 약 8배 증식되는 결과를 확인하였으며 전자현미경 촬영에서도 장벽에 형성된 콜로니의 증가가 관찰되었다.
○ 장 표면에서 살아있는 미생물의 이미지 관찰을 위하여 형광표지 된 L. plantarum-RFP 균주를 기존 장 오가노이드와 성숙 장 오가노이드에 미세주입 후 형광 시그널을 정량하고 생균수를 측정하였을 때에도 성숙 장 오가노이드에서 높은 증식을 나타내었으며, 면역염색을 통해 L. plnatarum-RFP 균주가 소장 오가노이드의 내강(lumen)위치에 위치하며, 장 상피세포의 상부 표면(apical surface)에 생착되어 있음을 관찰하였다.
□ 연구성과의 의미
▶ 숙주-공생미생물 연구 분야를 위한 진보된 연구모델 제시 : 강화된 기능성을 보유한 체외성숙 장 오가노이드 모델 기반 락토바실러스 생착 및 상호작용 연구 모델
○ 본 연구팀의 고유 기술인 장 오가노이드 체외성숙화 기술을 통해 제작된 성숙 장 오가노이드 모델은 성인 장 세포의 기능성을 모사하여 기존 미생물 연구를 위한 세포모델의 뮤신층 부족과 장 막 기능성(integrity)의 한계를 극복하고 미세주입기술을 적용하여 오가노이드 내부에서 락토바실러스 군집형성능을 향상시켜 장내미생물 연구모델로서의 개발을 가능하게 하였다.
○ 체외성숙화 기술을 적용한 장 오가노이드는 장내미생물 연구를 위한 가장 진화된 연구모델로서 인간 소장과 장내미생물 간의 상호작용 연구를 기반으로 인체 유익/유해성 평가 플랫폼 구현이 가능하게 하여, 보다 정확한 인체반응시스템으로 활용 될 것으로 기대된다.

연 구 결 과 문 답

이번 성과 뭐가 다른가

기존의 장내미생물 연구는 실험동물모델, 암세포주, primary cell과 같은 2차원 배양세포를 활용하였으나, 인간의 특성을 모사하기 어렵다는 한계를 가지기 때문에 정확한 숙주-장내미생물 연구모델로서의 한계가 있었다. 전분화능줄기세포 유래 장 오가노이드에 본 연구팀 고유 기술인 체외성숙화 기술을 적용시켜 보다 높은 인체 유사도를 반영하는 인간 소장 모델을 개발하여 성인 소장을 모사하는 장 오가노이드 기반 숙주-장내미생물 상호작용 연구모델의 토대를 마련하였다.

 

어디에 쓸 수 있나

장내미생물의 생착과 증식에 중요하게 활용되는 뮤신층 형성능이 강화되고, 장 막 기능(integrity)이 향상되어 있어 락토바실러스와 장 상피세포간의 상호작용 연구가 가능하며, 더 나아가 장내미생물이 인간 소장의 발달과 성숙에 미치는 영향, 인간세포와 미생물간의 생물학적 현상의 진화에 대한 연구가 가능할 것으로 기대된다

 

실용화까지 필요한 시간은

오가노이드 내부에 주입된 장내미생물의 증식능을 확인하긴하였으나, 실제 소장 내에는 한 종류의 미생물이 존재하는 것이 아니라 굉장히 많은 종의 미생물이 공생하고 있고, 면역세포, 혈관 등의 미세환경을 포함하여 실제 인체 환경과 유사성을 더 높이기 위해서는 시간이 필요할 것으로 에상된다.

 

실용화를 위한 과제는

현재는 통성혐기성 균주인 락토바실러스 균주를 대상으로 연구를 하고 있으나, 실제 장에는 절대혐기성 균주도 존재하기 때문에 산소 농도나 pH등 연구하고자 하는 장내미생물 특성을 반영하는 장 오가노이드의 미세환경 조절을 위해 지속적인 개선이 필요할 것이며, 이를 개선하고자 연구하고 있다.

 

연구를 시작한 계기는

장내미생물 군집 구성에 따라 영양분 흡수 양상, 면역체계의 변화 더 나아가 뇌와 신경 그리고 행동에 영향을 준다는 연구가 지속적으로 보고되고 있다. 최근 들어 마이크로바이옴 시장의 확대와 장내미생물 연구의 중요성이 증대되지만, 연구모델의 한계점으로 인해 장내미생물의 효용성 검증만이 가능하고 정확한 작용기전에 대한 연구가 거의 불가능하기 때문에 치료제로서의 접근방법을 선정하는데 어려움을 겪고 있다. 따라서, 최전선에서 장내미생물과 직접 상호작용하는 소장 세포 모델 개발의 필요성을 확인하였고, 기존 모델의 한계점을 뛰어넘는 진보된 형태의 3차원 오가노이드 모델을 개발하고자 연구를 시작하게 되었다.

 

에피소드가 있다면

장 오가노이드 내부에 락토바실러스를 처음 주입할 때 어려움을 많이 겪었다. 세포 중에서는 눈으로 보일 정도의 큰 사이즈의 오가노이드이기 때문에 큰 어려움이 없을 것이라 생각하고 겁 없이 시작했었는데, 정확한 수의 미생물을 손실없이 오가노이드 내부에 주입하기까지 꽤 오랜 시간이 걸렸다. 이 연구의 시작이었던 미세주입기술 확보에 시간과 노력을 많이 투자했는데, 여러 시행착오에도 불구하고 주변 동료들로부터 받은 많은 조언과 격려 덕분에 안정적으로 기술을 확립할 수 있었다.

 

꼭 이루고 싶은 목표는

인간을 구성하는 수많은 장기들은 각자 역할을 하는 것이 아니라 결국 통합된 하나의 시스템으로 작용한다. 윤리문제가 대두되고 있음에도 불구하고 현재까지 실험동물이 연구에 많이 활용되는 것은 systemic effect를 가장 잘 반영하는 모델이기 때문이다. 오가노이드 모델이 최초로 개발된 시점으로부터 Organ-on-Chip 또는 티슈칩(Tissue Chip)등 동물모델의 장점을 모사할 수 있는 다장기 모델에 대한 연구가 지속적으로 이루어지고 있다. 현재는 장내미생물이 직접 영향을 미치는 소장 연구를 수행하고자 체외성숙화 장 오가노이드 모델을 개발하기 위해 노력했다면, 향후에는 장내미생물이 소장을 거쳐 타장기에 미치는 연구에 본 연구팀의 세포모델이 유용한 연구모델로 활용될 수 있기를 바란다.

 

신진연구자를 위한 한마디

자연에는 아직도 연구되지 않은 무궁무진한 연구소재가 있는 것처럼 연구를 시작하는 모두에게 발전할 수 있는 가능성과 기회가 열려있다고 생각한다. 끊임없이 도전하고 연구를 수행함에 주변 동료들과 소통하고 협력하여 목표를 향해 달려간다면 더욱 발전된 연구결과를 얻을 수 있을 것이라 기대합니다.

용 어 설 명

1. 마이크로바이옴 (microbiome)
◦ 미생물을 의미하는 ‘microbe’와 생태계를 의미하는 ‘biome’의 합성어로 인간 장내미생물과 미생물의 유전정보를 뜻하며, 인체 내외부에서 상호작용하는 모든 미생물과 유전정보를 통칭하는 의미로 사용된다.
2. 숙주-장내미생물 상호작용 연구
◦ 장내미생물 연구의 핵심요소로 신호전달기전, 생리적 변화 등 미생물이 숙주에 미치는 영향에 대한 연구를 수반한다.
3. 전분화능줄기세포 (pluripotent stem cells)
◦ 인간의 몸을 구성하는 모든 세포를 만들 수 있는 능력을 가진 세포로, 자기재생능(self-renewal)과 분화능(differentiation potential)을 가지는 특성을 지닌 세포이다. 크게 배아줄기세포와(embryonic stem cells, ESCs) 유도만능 줄기세포(induced-pluripotent stem cells, iPSCs)로 구분된다.
4. 장 오가노이드 (Intestinal organoids)
◦ 소장-특이적인 세포를 3차원 배양을 통해 응집시켜 만든 소장 장기 유사체를 말하며, 전분화능 줄기세포와 성체줄기세포로부터 제작이 가능하다.
5. 체외성숙화 (In vitro maturation)
◦ 본 연구팀의 독자적인 기술로, 인간 소장 환경을 모사하기 위해 면역세포 유래 IL-2 처리를 통해 전분화능 줄기세포 유래 3차원 장 오가노이드의 기능적 생리학적 특성을 성인의 소장을 모방할 수 있도록 증진시키는 기술이다.
6. 락토바실러스 (Lactobacillus)
◦ 그람양성 통성혐기성(facultative anaerobic)균으로 다양한 식품, 과일, 토양이나 인간의 소화기간에 서식하며 젖산발효를 통해 유산을 생성한다. 출산과 모유수유 과정중 신생아 장에 다량 생착되는 것으로 알려져 있으며, 인간 전 생애에 걸쳐 장에 분포하는 특징을 가진다.
7. 미세주입 기술 (microinjection)
◦ 현미경하에서 직경 1mm 유리모세관을 늘려 끝이 직격 20~30μm가 되도록 제작하고 미세피펫을 부착시켜 마이크로메니풀레이터 (microman-
upulator)를 사용하여 주입하는 기술이다. 본 연구에서는 락토바실러스를 오가노이드 내 주입 시 사용하였다.

그 림 설 명

 

그림1. 인간 전분화능 줄기세포 유래 체외 성숙 장 오가노이드의 특성 획득
(A) 장 오가노이드 분화과정 및 체외 성숙화 프로세스 모식도. (B,C,D) microarray, qPCR, Immunostaining을 통한 뮤신 합성-연관 마커 발현 분석. (E) AB/PAS staining을 통한 뮤신층 형성능 분석

그림 2. 체외 성숙 오가노이드 내 락토바실러스 증식률 증가 분석
(A-B) 기존 오가노이드와 체외 성숙 오가노이드 내 미세주입 된 L.plantarum-RFP의 형광 발현량 분석. (C) Immunostaining을 통한 기존 및 체외 성숙 장 오가노이드 apical surface에 부착된 L. plantarum-RFP 비교 (D-E) 생균수 측정을 통한 오가노이드 내 L.plantarum 증식율 확인.

손미영 박사 이력사항

1. 인적사항

o 소 속 : 한국생명공학연구원
줄기세포연구센터 책임연구원

2. 경력사항

o 2000 - 2001 ㈜바이오니아 주임연구원
o 2001 - 2004 한화케미칼(주) 중앙연구소 주임연구원
o 2005–2014 한국생명공학연구원 전임연구원
o 2014–2018 한국생명공학연구원 선임연구원
o 2018–현재 한국생명공학연구원 책임연구원
o 2015 - 현재 과학기술연합대학원대학교 교수

3. 전문 분야 정보

o 인간 장관 오가노이드 (Human intestinal organoid) 활용 기술
o 조직-특이적 세포 및 3차원 오가노이드 분화 기술
o 줄기세포 기반 질환 모델링

박두상 박사 이력사항

1. 인적사항

o 소 속 : 한국생명공학연구원
생물자원센터 책임연구원

2. 경력사항

o 1996 – 2001 한국생명공학연구원 연구원
o 2001 - 2012 한국생명공학연구원 선임연구원
o 2008 - 2009 Biodiversity Institute of Ontario (Visiting Researcher)
o 2012 – 현재 한국생명공학연구원 책임연구원
o 2013 - 현재 과학기술연합대학원대학교 교수

3. 전문 분야 정보

o 미생물 자원의 확보․관리 및 활용
o 프로바이오틱스 균주은행 구축 및 특성분석
o 숙주-미생물 상호작용