Cpf1 유전자 가위의 대용량 검증기술 세계 최초 개발 - 효율적인 유전자가위 제작 및 검증의 산업화에 기여할 것으로 기대
작성일 : 2016. 12. 21. 생명기술과
Cpf1 유전자 가위의 대용량 검증기술 세계 최초 개발
- 효율적인 유전자가위 제작 및 검증의 산업화에 기여할 것으로 기대 -
□ 미래창조과학부(장관 최양희, 이하 ‘미래부’)는 국내 연구진의 Cpf1 유전자가위의 대용량 검증기술 개발로 비용 및 노동력 측면에서 30-100배의 절감효과를 보이며 효율적인 유전자가위의 생산 및 검증의 산업화에 기여할 것으로 기대한다고 밝혔다.
ㅇ 미래창조과학부 바이오‧의료기술개발사업의 지원을 받은 연세대 의대 김형범 교수 연구팀의 이번 연구 결과는 생명과학분야의 권위 있는 학술지인 네이쳐 메소드(Nature Methods, IF=25.328) 온라인판 12월 19일자에 게재되었다.
- 논문명 : In vivo high-throughput profiling of CRISPR-Cpf1 activity
- 저자정보 : 김형범(교신저자, 연세대 의과대학 교수), 김희권(제1저자, 박사과정생), 송명재(제1저자, 박사과정생)
□ 성공적인 유전체 교정을 하기 위해서는 CRISPR 유전자가위가 정확한 위치에 작용할 수 있도록 유도해주는 가이드RNA*를 선정하는 것이 필수적이나,
ㅇ 이전까지는 가이드 RNA를 일일이 제작하여 실험적으로 선정하였기 때문에 비용과 인력의 효율적 사용이 어려운 실정이였다.
* 가이드 RNA : CRISPR 유전자가위의 구성 요소로 특정 염기서열에 붙을 수 있도록 유도하여 염기서열을 결정함.
□ 본 연구의 김형범 교수팀은 기존 방식에서 벗어나 수천만의 가이드RNA가 작용하는 표적 염기서열의 라이브러리가 유전자가위에 의해 변화하는 정도를 차세대 염기서열 분석법(NGS)*를 통해 대량으로 확인하였으며, 실제 세포내에서 일어난다는 점을 고려하여 시험관에서 측정하는 방식이 아닌 인간배양세포에서 가이드 RNA의 효율을 측정하여 정확성을 높였다.
ㅇ 이를 통해 Cpf1 가이드RNA의 효율을 예측하는 알고리즘을 개발하여 10,000개 이상의 대량의 가이드RNA의 효율성 및 정확성을 한번에 검증하는 방법을 고안 하였다.
* 차세대염기서열분석법(NGS) : 유전체의 염기서열 고속 분석 방법으로, 기존 분석과 달리 많은 수의 DNA조각을 병렬로 처리한다.
□ 김형범 교수팀은 “이번 기술 개발을 통하여 유전자가위 제작 및 검증의 산업화를 이루는 단초가 마련되었으며, 유전체 교정연구 속도를 성공적으로 높여 향후 유전자 편집 기술을 이용하는 신약 파트 등 다양한 분야에 폭넓은 파급효과가 기대된다.”고 연구 의의를 밝혔다.
<참고자료> : 1. 논문의 주요내용 및 연구결과 개요 2. 연구이야기. 3. 용어설명 4. 그림설명 5. 연구자 이력사항
논문의 주요내용 및 연 구 결 과 개 요
1. 연구의 필요성
◯ CRISPR 유전자가위를 이용한 유전체 교정의 효율 및 정확성은 유전자가위 단백질과 결합하는 가이드RNA에 의해 결정된다. 따라서 유전자 교정을 하기에 앞서 높은 효율 및 정확성을 가진 가이드RNA를 선정하는 과정이 필수적이나, 이전까지는 가이드RNA를 일일이 제작하여 실험적으로 효율 및 정확성을 검증하는 노동집약적인 검증 단계를 거쳐야했다.
◯ CRISPR 유전자 가위에 Cas9과 Cpf1이 있으며 이 중 Cpf1은 최근에 발견된 유전자 가위이다. 기존에 알려진 Cas9과 Cpf1 유전자 가위는 서로 특성이 달라 효율 및 정확성이 높은 가이드RNA 선정을 할 수 있는 기준이 명확하지 않다.
2. 연구 방법
◯ 연구팀은 CRISPR-Cpf1 유전자가위의 가이드RNA와 각 가이드 RNA의 표적 DNA가 짝을 이루는 형태의 라이브러리를 제작하여 인간배양세포에 전달하였다. 이 인간배양세포에 CRISPR-Cpf1 유전자가위를 전달한 후 표적 DNA의 변화 정도를 차세대 염기서열 분석 (NGS) 방법을 이용하여 확인함으로써 11,000개 가이드RNA의 교정효율 및 정확성을 한 번에 측정했다.
3. 연구 성과
◯ 본 연구팀에서 개발한 방법은 가이드RNA를 하나하나 검증하는 기존의 방법에 비해 비용/노동력 면에서 월등한 30-100배의 절감효과를 보였다.
◯ 더불어, 이러한 가이드RNA 검증 방법을 이용하여 2015년에 발견된 CRISPR-Cpf1 유전자가위의 Proto-spacer adjacent motif (PAM) 염기서열, 가이드RNA 염기서열에 따른 활성도, 가이드RNA의 정확성에 중요한 motif 등을 밝혀냈다.
◯ 개발한 가이드RNA 검증 방법을 이용하여 얻은 대용량 데이터를 Machine learning 방법을 이용해 분석하여 가이드RNA의 효율을 예측하는 알고리즘을 구축하였다.
□ 연구배경
ㅇ CRISPR 유전자 가위는 유전자의 특정 부위를 절단할 수 있는 인공 제한 효소로 가이드RNA와 Cas9이라는 단백질이 결합하여 특정 염기서열을 인식하여 DNA의 이중 나선 가닥을 자르게 된다. 특정 부위를 인식하는 역할을 수행하는 것이 가이드RNA로 가이드RNA 내의 염기서열에 따라 효율과 정확성등 차이가 나게 된다. 따라서 CRISPR 유전자 가위를 이용한 유전체 교정을 수행하기 위해서는 고효율이면서 원하는 위치만 절단하는 가이드RNA의 선정이 우선시 되어야 한다.
ㅇ 약 1 Kb의 염기서열 내에서 디자인이 가능한 가이드RNA의 수는 100 ~200개의 가이드RNA를 제작 할 수 있으며 인간 전체 염기서열에서 제작할 수 있는 가이드RNA는 수 천만에 달한다. 가이드RNA의 DNA 이중 나선 가닥을 자르는 효율이 높으면서 비특이적 DNA의 절단을 최소한으로 일으키는 가이드RNA를 선별하기 위해 개별적으로 확인하는 것은 불가능하다.
ㅇ CRISPR 유전자 가위에서 DNA의 절단 효능을 가진 단백질이 필요하다. 현재까지 알려진 단백질은 Cas9과 Cpf1 등이 있다. 두 단백질 모두 가이드RNA와 결합하여 특정 염기서열에 작용하는 것은 동일하지만 가이드RNA의 길이, PAM 염기서열, DNA 염기서열을 자르는 위치 및 잘린 모양 등이 차이가 난다고 알려져 있다. Cas9의 경우 많은 연구 등을 통해 고효율이면서 비특이적 절단이 줄일 수 있는 가이드RNA의 선정 기준 등이 마련되어 있지만 Cpf1의 경우 아직까지 알려진 바가 없어 사용이 어렵다.
ㅇ 이에 대해 김형범 교수팀의 이번 논문은 대용량으로 가이드RNA의 효율과 정확성을 검증할 수 있는 방법을 개발하였으며, 본 방법을 통해 Cpf1 가이드RNA의 특징들을 밝히고자 하였다.
□ 연구내용
▶ 대용량으로 Cpf1 유전자 가위의 효율 및 정확성을 검증하는 방법 개발
- 김형범 교수 연구팀은 Cpf1 유전자 가위의 가이드RNA와 각 가이드RNA가 작용하는 표적 염기서열을 짝을 이루도록 하여 라이브러리를 제작하였다. 제작 된 라이브러리를 인간배양세포에 전달하여 표적 염기서열의 변화 정도를 차세대 염기서열 분석법(NGS)를 통해 확인함으로써, 11,000여개의 가이드RNA의 교정효율 및 정확성을 한 번에 측정하였다. 이러한 방법은 기존 가이드RNA의 효율 측정에 비해 비용 및 노동력 측면에서 30~100배의 절감효과를 보였다.
▶ Cpf1의 PAM 염기서열 확인
- Cpf1 단백질이 작용하기 위한 PAM(Proto-spacer adjacent motif) 염기서열은 5'-TTTN-3'으로 알려져 있었다. 이 결과는 in vitro상에서 확인 한 결과였으며, 김형범 교수 연구팀은 인간배양세포에서도 동일한 PAM 염기서열을 가지는 지 확인한 결과 기존에 알려진 사실과는 다른 PAM을 가지는 것을 확인하였다. 기존에 알려진 PAM 중 5'-TTTT-3'를 PAM으로 가지는 가이드RNA의 유전자 교정 효율이 상대적으로 낮았으며, 이는 TTTT 염기서열은 PAM 염기서열로는 충분치 않다는 결과를 보여 Cpf1 유전자 가위의 PAM은 TTTV로 새롭게 정의 내렸다.
* PAM 염기서열 : 가이드RNA와 다르게 CRISPR 유전자가위 단백질이 직접 인식하는 염기서열이며, 유전자가위에 의한 DNA 이중 나선 가닥의 절단 여부를 결정하는데 핵심 역할을 한다.
▶ Cpf1 가이드RNA 효율을 예측하는 알고리즘 개발
- 유전자가위의 효율 및 정확성을 결정하는 데 가이드RNA의 염기서열이 매우 중요하다. 효율적인 Cpf1 가이드RNA를 선정하는 기준을 만들고자 김형범 교수 연구팀은 대용량 처리 기법을 통해 다양한 가이드RNA의 활성을 측정하여 가이드RNA의 염기서열과 활성의 상관관계를 분석하여 가이드RNA의 효율을 예측하는 알고리즘을 세계 최초로 구축하여 웹서비스를 시작하여 전 세계 연구자와 공유 중이다.
□ 기대효과
ㅇ 본 연구 결과는 Cpf1 유전자가위 가이드RNA의 효율 및 정확성을 대용량으로 검증할 수 있는 시스템을 구축하여 비용 및 노동력 절감을 이루어 효율적인 유전자가위 생산을 할 수 있을 것으로 기대된다.
ㅇ 본 연구를 통해 도출된 결과를 토대로 Cpf1 유전자가위 가이드RNA의 효율을 예측하는 알고리즘을 구축하여 향후 효율적인 Cpf1 유전자가위를 디자인하는 기준이 될 것으로 기대된다.
★ 연구 이야기 ★
□ 연구를 시작한 계기나 배경은?
우리 연구실에서 오랜 시간동안 유전자가위를 이용한 연구를 진행했는데 매번 유전자가위의 활성을 확인하는 데 어려움을 겪었다. Cas9의 경우 다양한 그룹에서 연구를 진행하여 효율이 높은 가이드RNA를 선정하는 데 도움이 될만한 정보들이 있으나 예측된 효율과 실제 실험결과가 다른 경우가 많았으며 Cpf1의 경우 그 만한 정보도 부족하여 가이드RNA의 제작에 특히 어려웠다.
□ 연구 전개 과정에 대한 소개
본 연구에 있어 가장 중요한 것은 대용량으로 가이드RNA의 효율을 검증할 수 있는 시스템을 구축하는 데 있었다. 다양한 방법을 논의 한 끝에 가이드RNA와 표적 염기서열을 짝을 이루어 라이브러리를 만드는 방법을 고안했고, 시스템을 구축할 수 있었다. 구축 된 시스템에서 Cpf1 유전자가위의 PAM 염기서열 및 가이드RNA 염기서열에 따른 활성도, 가이드RNA의 정확성에 중요한 motif 등을 밝혀 최종적으로 Cpf1 가이드RNA의 효율을 예측하는 알고리즘을 개발하였다.
□ 연구하면서 어려웠던 점이나 장애요소가 있었다면 무엇인지? 어떻게 극복(해결)하였는지?
본 연구는 기존에 하던 연구와 달리 대용량으로 처리하는 방법으로 접근하였기 때문에 실험의 처음부터 끝까지 실험실에서 처음으로 시도하는 방법들이었다. 모든 실험이 참고문헌에 나온 내용에 의지해서 진행을 해야 했기 때문에 실험 과정의 나온 결과에 대한 확신을 갖기 어려웠다. 결국 연구팀 내에서의 끊임없는 논의를 통해 해당 어려움을 극복할 수 있었고 처음으로 염기서열 분석한 데이터를 받아 분석하여 결과가 예측한 결과대로 나왔던 그 순간을 잊을 수 없다.
□ 이번 성과, 무엇이 다른가?
유전자 가위를 대량으로 검증할 수 있는 방법의 개발에 가장 큰 의의를 둘 수 있다. 기존의 유전자 가위의 효율을 검증하기 위해서는 개별적인 실험을 통해 확인해야만 했는데 많은 수를 한 번에 확인하는 데는 어려움이 있었을 뿐 더러 각각의 실험 조건에 따라 결과의 편차가 있어 여러 번 확인을 해야 했다. 본 방법으로는 최대 100,000개의 가이드RNA를 한 실험에 확인 할 수 있기 때문에 실험 조건에 따른 편차 등을 줄일 수 있다.
□ 꼭 이루고 싶은 목표와, 향후 연구계획은?
이번 연구를 통해 구축 된 시스템을 토대로 유전자가위의 활성을 확인하여 최상의 유전자가위를 선정할 수 있게 되었다. 선정된 유전자가위를 이용하여 다양한 유전적 질환을 교정하는 연구를 진행하여 유전질환을 극복하는 연구를 할 예정이다.
□ 기타 특별한 에피소드가 있었다면?
본 연구를 마무리하기까지 많은 어려움이 있었다. 앞서 말했다시피 모든 실험이 기존에 해오던 실험적 테크닉을 사용할 수 없어 모든 실험을 참고문헌에만 의존해서 진행해야 했기 때문에 실험이 실패하는 경우가 많았다. 이 때마다 연구진끼리 잦은 논의를 통해 문제들을 해결할 수 있었다.
본 연구를 마무리하는 과정 중 Cpf1 유전자가위의 특성에 대한 연구가 해외 연구진에 의해 보고되어 본 연구의 발표가 무산 될 위기가 있었지만 연구진끼리 합심하여 더 좋은 결과를 낼 수 있었다.
용 어 설 명
1. 네이쳐 메소드 저널 (Nature Methods)
ㅇ 바이오 분야의 새로운 실험 방법을 개발하여 관련된 연구 결과를 다루는 최고의 권위지※ IF 25.3
2. Cpf1 유전자가위 (CRISPR from Prevotella and Francisella 1)
ㅇ Prevotella and Francisella 1으로부터 처음 발견된 유전자가위로 가이드RNA와 결합하여 특정 부위의 염기서열의 이중 나선 가닥을 자르는 효소임.
4. 가이드RNA (guide RNA)
ㅇ CRISPR 유전자가위의 구성 요소로 특정 염기서열에 붙을 수 있도록 염기서열을 결정함.
5. PAM 염기서열 (Proto-spacer adjacent motif)
ㅇ 가이드RNA와 다르게 CRISPR 유전자가위 단백질이 직접 인식하는 염기서열이며, 유전자가위에 의한 DNA 이중 나선 가닥의 절단 여부를 결정하는데 핵심 역할을 한다.
그 림 설 명
그림 1. 본 연구에서 개발한 유전자가위 대량검증법
a) 유전자가위 대량검증을 위한 가이드RNA와 각 가이드RNA가 작용하는 표적 염기서열을 짝을 이루어 디자인한 모습
b) 디자인 된 가이드RNA와 표적 염기서열 라이브러리를 세포 내 전달하여 활성을 최종적으로 측정하는 실험방법.
김형범 교수 이력사항
1. 인적사항
○ 소속 : 연세대학교 의과대학 약리학교실
2. 경력사항
○ 2001 - 2003 연세대학교 의과대학 조교
○ 2003 - 2006 질병관리본부 국립보건연구원 공중보건의사/선임연구원
○ 2007 - 2008 CSEMC/Tufts University, 박사후 연구원
○ 2008 - 2010 Emory University School of Medicine, 박사후 연구원
○ 2010 - 2011 차의과학대학교 조교수
○ 2011 - 2015 한양대학교 의생명공학전문대학원 조교수/부교수
○ 2015 - 현재 연세대학교 의과대학교 약리학교실 조교수/부교수
3. 수상
○ 분쉬의학상 젊은의과학자상 (2013)
○ 젊은과학자상, 대통령상 (2014)
○ 아산의학상 젊은의학자상 (2015)
4. 대표 논문
○ Kim HK, Song M, Lee J, Menon AV, Jung S, Kang YM, Choi JW, Woo E, Koh HC, Nam JW, Kim H+ (+Correspondingauthor). In vivo high-throughput profiling of CRISPR-Cpf1 activity. Nat.Methods. In press.
○ Kim YH, Kim HO, Baek EJ, Kurita R, Cha HJ, Nakamura Y, Kim H+ (+Correspondingauthor). Rh D blood group conversion using transcription activator-like effector nucleases. Nat.Commun., 2015 Jun 16; 6:7451.
○ Ramakrishna S, Dad A-B D, Beloor J, Gopalappa R, Lee S-K, KimH+ (+Correspondingauthor). Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA. GenomeRes., 2014 Jun; 24(6):1020-7. (Featured on the cover; http://genome.cshlp.org/content/24/6.cover-expansion).
○ Kim H, Kim JS. A guide to genome engineering with programmable nucleases. Nat.Rev.Genet., 2014 May; 15 (5): 321-334.
○ Ramakrishna S, Cho SW, Kim S, Song M, Gopalappa R, Kim JS+, Kim H+ (+Correspondingauthors). Surrogate reporter-based enrichment of cells containing RNA-guided Cas9 nuclease-induced mutations. Nat.Commun., 2014 Feb 26; 5: 3378.
○ Kim H, Um E, Cho SR, Jung C, KimH+, and KimJS+ (+Correspondingauthors). Surrogate reporters for enrichment of cells with nuclease-induced mutations. Nat.Methods, 2011 Oct 9;8:941-3. (Featured in Chemical & Engineering News, http://pubs.acs.org/cen/news/89/i42/8942notw4.html)
김희권 연구원 이력사항
1. 인적사항
○ 소 속 : 연세대학교 의과대학 의과학과, 약리학교실
2. 수상실적
3. 논문실적
○ Kim HK, Song M, Lee J, Menon AV, Jung S, Kang YM, Choi JW, Woo E, Koh HC, Nam JW, Kim H+ (+Correspondingauthor). In vivo high-throughput profiling of CRISPR-Cpf1 activity. Nat.Methods. In press.
○ Beck BR, Kim D, Jeon J, Lee SM, Kim HK, Kim OJ, Lee JI, Suh BS, Do HK, Lee KH, Holzapfel WH, Hwang JY, Kwon MG, Song SK+ (+Correspondingauthor). The effects of combined dietary probiotics Lactococcus lactis BFE920 and Lactobacillus plantarum FGL0001 on innate immunity and disease resistance in olive flounder (Paralichthys olivaceus). Fish & shellfish immunology, 2015 Jan 42(1), 177-183.
송명재 연구원 이력사항
1. 인적사항
○ 소 속 : 한양대학교 의생명전문대학원 의생명과학과
2. 수상실적
3. 논문실적
○ Kim HK, Song M, Lee J, Menon AV, Jung S, Kang YM, Choi JW, Woo E, Koh HC, Nam JW, Kim H+ (+Correspondingauthor). In vivo high-throughput profiling of CRISPR-Cpf1 activity. Nat.Methods. In press.
○ Chung WY, Song M, Park J, Namkung W, Lee J, Kim H, Lee MG, Kim JY. Generation of ΔF508-CFTR T84 cell lines by CRISPR/Cas9-mediated genome editing. Biotechnol Lett. 2016 Dec;38(12):2023-2034.
○ Seo JH, Lee MY, Yu JH, Kim MS, Song M, Seo CH, Kim HH, Cho SR. In Situ Pluripotency Factor ｅxpression Promotes Functional Recovery From Cerebral Ischemia. Mol Ther. 2016 Sep;24(9):1538-49.
○ Kim H, Han JW, Lee JY, Choi YJ, Sohn YD, Song M, Yoon YS. Diabetic Mesenchymal Stem Cells Are Ineffective for Improving Limb Ischemia Due to Their Impaired Angiogenic Capability. Cell Transplant. 2015 ; 24 (8) : 1571-84
○ Ramakrishna S, Cho SW, Kim S, Song M, Gopalappa R, Kim JS+, Kim H+ (+Correspondingauthors). Surrogate reporter-based enrichment of cells containing RNA-guided Cas9 nuclease-induced mutations. Nat.Commun., 2014 Feb 26; 5: 3378.
○ Kim DS*, Kim H*, Ssim SH*, Kim C, Song M, Kim YH, Jung YW, Nam JH (*equally contributed). Coxsackievirus B3 used as a gene therapy vector to express functional FGF2. GeneTher. 2012 Dec;19(12):1159-65