나노입자 검출 예쁜꼬마선충 칩 개발

나노입자 검출 예쁜꼬마선충 칩 개발

 

등록일 2017-01-23

 

 

 
나노입자 검출 예쁜꼬마선충 칩 개발
 

□ 한국연구재단(이사장 조무제)은 최신식(명지대) 교수 연구팀이 은나노입자를 검출하고 생체 독성을 바로 파악할 수 있는 예쁜꼬마선충* 칩을 개발했다고 밝혔다.  
    * 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans) : 몸길이 1 mm 정도의 토양 선충의 일종. 박테리아를 먹이로 자람． 

□ 나노기술의 지속적인 발전과 더불어 나노입자를 포함한 다양한 나노물질이 자연, 생활 환경에 무분별하게 유입되는 현실에서 생체 유해성을 고려한 나노입자의 검출이 필요하다.    

□ 나노입자는 크기가 100 나노미터 내외로 매우 작아 존재 여부의 판별이 매우 어렵다. 은 나노입자의 경우 숙련된 전문가가 고가의 큰 분석 장비들을 사용하여 입자의 존재 가능성을 예측할 수 있으나, 생물학적 독성 측정은 많은 시간과 노동력이 필요하다.

□ 은 나노입자가 동물 몸 안으로 들어갔을 때 나타나는 몸체 크기, 거동 변화, 특정 유전자 과다 발현을 이용하여 은 나노입자의 생체 유입과 유해성을 쉽게 눈으로 검출하는 바이오칩이다. 예쁜꼬마선충이라는 동물이 나노입자를 먹은 후, 몸이 보이는 반응을 칩 상에서 쉽게 판별할 수 있도록 하였다. 

□ 최신식 교수는 “이 연구성과는 환경 및 인체 유해성이 제기되는 나노물질을 효과적으로 검출할 수 있는 미세유체 동물 칩을 개발한 것이다. 향후 수질환경 검사, 식품 안전성 검사, 의료 분야 등에 적용될 수 있을 것이다.”라고 연구의 의의를 설명했다.

□ 이 연구성과는 교육부한국연구재단의 이공학개인기초연구사업의 지원을 받아 수행되었다. 네이처(Nature) 자매 학술지인 싸이언티픽 리포트(Scientific Reports) 1월 9일자에 게재되었다.

<참고자료> : 1. 논문의 주요내용
             2. 연구결과 개요
             3. 연구이야기
             4. 용어설명
             5. 그림설명
             6. 연구자 이력사항

논문의 주요 내용

□ 논문명, 저자정보

   - 논문명 : C. elegans-on-a-chip for in situ and in vivo Ag nanoparticles’ uptake and toxicity assay
   - 저자 정보 : 최신식 교수 (교신저자, 명지대학교 식품영양학과 / 에너지융합공학과), 김진호 (제1저자, 명지대학교 에너지융합공학과), 이승환 박사 (공동 제1저자, 서울대학교 화학생물공학부), 차윤정, 홍성진, 정상국 교수, 박태현 교수 

□ 논문의 주요 내용

 1. 연구의 필요성
   ○ 나노기술과 각광과 함께 최근 그 환경 안정성에 대한 논란이 커지고 있음. 나노물질은 크기가 작아 혼합물로부터 분리가 용이하지 않고, 분석을 위해 고가의 장비, 많은 시간과 노동력이 필요함. 이를 단축시킬 수 있는 기술이 필요함.

 2. 연구 내용
  ○ 예쁜꼬마선충을 장시간 안정적으로 배양하는 공간과 몸체를 상하지 않으면서 고정하여 내·외관을 쉽게 관찰할 수 있는 채널을 가지는 미세유체 칩을 반도체 제조 공정 기술을 응용하여 대량으로 제작함．
   ○ 예쁜꼬마선충을 투명한 고분자성 재료의 마이크로미터크기를 가지는 미세유체 칩 안에서 배양, 고정한 후에 은 나노입자가 함유된 액체를 흘려보내 동물 체내에 유입시켜 동물의 크기 감소, 거동 변화, 특정 유전자 발현량 증가 등의 차이를 비교 측정함.
   ○ 예쁜꼬마선충은 몸이 투명함. 따라서 투명한 미세유체 칩에 배양 및 고정 시 체내 유전자(단백질) 발현을 형광 표지 등으로 관찰하기 용이하며, 이러한 유전자가  나노입자에만 선택적으로 과다 발현되는 특징이 있어 나노물질과 기타 중금속 이온들 사이의 구별이 가능함.  

3. 연구 성과
   ○ 예쁜꼬마선충 칩을 이용한 은 나노입자의 검출과 생체 독성 분석이 대조군과 함께 육안으로도 비교가 가능한 칩을 개발하는데 성공하였다. 더불어 은 나노입자가 예쁜꼬마선충의 체내로 유입될 시 특이적으로 과다 발현되는 유전자에 형광표지를 붙여 칩에서 판별이 가능하게 하는데 성공함.
   ○ 은 나노입자와 비슷한 물리화학적 성질을 가져 검출에 방해를 줄 수 있는 중금속이나 다른 나노입자와 비교 연구를 통해, 은 나노입자에 특이적으로 사용 가능함을 증명하는데 성공함.
   ○ 식품, 화학, 의료, 생활용품 등 나노물질이 사용되는 모든 분야에의 나노물질 검출 및 유해성, 안전성 검사에 적용할 수 있을 것으로 기대됨. 

연 구 결 과  개 요

 1. 연구배경
  ㅇ 환경 분야에는 여러 지표 생물이 있으며, 그러한 동·식물 종을 통해 오염을 미리 인지하거나 오염 여부를 확인할 수 있다. 가령, 방사능 오염이 일어나면, 꽃잎의 색이 빠르게 변화되어 오염 여부를 판가름하는 식물 종도 있다.
  ㅇ 이 연구는 왕의 식사를 확인하는 기미나인과 같이 누군가를 대신해 나노입자를 먹은 후, 지표 생물처럼 인과 관계에 정확한 과학적 메커니즘을 통해 월드컵 문어처럼 빠른 속도로 판단 결과와 정보를 알려줄 수 있는 장치는 없을까? 하는 아이디어에서 시작하게 되었다. 
  ㅇ 나노기술이 급속도로 발전함에 따라 인간과 환경에 노출되는 나노물질에 대한 좋지 않은 영향이 제기되기 시작했고, 최근 미국과 캐나다, 호주 등 선진국들을 필두로 많은 국가들이 나노물질에 대한 안전성과 사용 규제를 시작했다. 이에 연구팀은 나노물질의 검출과 독성을 생명체에서 쉽고 빠르게 검출할 수 있는 미세유체 동물 칩 개발을 착안했고, 그 활용 가능성을 토양 선충인 예쁜꼬마선충과 은 나노입자를 통하여 검증하는 연구를 진행하게 되었다.
 
 2. 연구내용
  ㅇ 최근 제작 및 활용이 용이한 미세유체 칩을 활용해 예쁜꼬마선충의 거동을 확인하는 연구들이, 선충을 다루는 데 필요한 시간과 과정을 크게 단축시킬 수 있다는 효율성과 투명한 미세유체 칩을 통해 모니터링이 쉽게 가능하다는 등의 장점으로 인해 활발히 이뤄지고 있다.
  ㅇ 정상적으로 성장하여 성충의 단계에 돌입한 예쁜꼬마선충은 1250~1400 μm의 몸길이와 70~90 μm의 몸통 두께를 가진다. 이와 동시에, 예쁜꼬마선충이 유해 물질에 노출되는 경우 성장이 저해된다는 사실이 많은 연구를 통해 알려진 점에 착안해 가시적으로 거동 관찰이 가능한 미세유체 동물 칩으로의 활용을 제안했다. 
  ㅇ PDMS 소재로 만들어진 미세유체 동물 칩 내부를 은 나노 입자 분산 용액으로 채운 후에 예쁜꼬마선충을 노출시키고, 일정 배양시간을 거친 뒤 칩 안에서 선충을 고정시켜 몸길이, 이동거리, 형광 발현 등을 측정하는 것으로 진행됐다. 
  ㅇ 최초로 24시간 노출시킨 결과, 대조군과 대비하여 일정 농도 범위에서 성장 저해를 보였다. 다음으로, 검출의 효율성을 높이기 위해서 6시간으로 단축하여 은 나노 분산 용액에 노출시킨 결과, 앞선 실험과 비슷한 경향으로 일정 농도 범위에서 성장 저해를 보인 것을 확인했다. 
  ㅇ 성장이 저해된 경우에, 몸길이뿐만 아니라 몸통 두께도 정상적인 성장 범위에 이르지 못하기 때문에, 점점 좁아지는 칩의 구조에서 대조군과 실험군의 이동거리 차이를 확인할 수 있었다. 
  ㅇ 성장 저해가 은 나노의 독성이 아닌, 은 이온의 영향일 수도 있다는 점을 확인하기 위하여, 같은 방법으로 동일 농도의 은 이온에 예쁜꼬마선충을 노출시킨 결과, 성장 저해 경향은 발견할 수 없었다.
  ㅇ 은 나노가 체내로 들어올 경우, 특이적으로 高발현되는 MTL-2 유전자에 형광표지를 붙여, 형광을 통해서 은 나노의 유입 여부와 독성 유무 검출이 가능함을 보였다. 
  ㅇ 연구팀은 미세유체 동물 칩의 활용도를 높이기 위하여 다른 물질에의 적용을 제안했고, 그에 따라 금 나노입자 및 카드뮴을 은 나노와 동일 농도에서 노출한 결과, 나노입자만이 동물 성장과 형광발현에서 유의적인 차이를 보였다.

3. 기대효과
  ㅇ 이 연구를 통해 개발된 미세유체 동물 칩은 환경, 식품 등의 분야에서 나노입자를 포함한 중금속 등 유해 물질 검출 등에 활용될 것으로 전망된다. 
  ㅇ 저배율 현미경 외에 기타 분석 장비 도움 없이 육안으로 확인이 가능한 검출도구로서의 응용적 기초를 마련하여 차세대 유해 물질 검출도구의 구현을 가능하게 할 것이다.
  ㅇ 특정 유해 물질의 자극에 반응하는 유전자의 발현을 실시간으로 모니터링 할 수 있는 실험적 기초를 마련하여, 진단 등 의료 분야 등에서의 다양한 응용을 제안했다. 
  ㅇ 은 나노뿐만 아니라, 다른 종류의 나노입자에 대해서 특이적으로 발생하는 예쁜꼬마선충의 생리적 변화나 특이적으로 高발현되는 유전자를 발굴하면, 다양한 나노재료에 대해서 검출이나 독성 측정이 가능한 플랫폼 기술로 확장이 가능하다. 

★ 연구 이야기 ★

□ 연구를 시작한 계기나 배경은?

예쁜꼬마선충은 유전자 염기서열이 모두 밝혀진 동물모델로, 인간 유전자와 매우 높은 유사성을 보인다는 점과 체내가 현미경으로 들여다 볼 수 있을 만큼 투명하다는 등의 이점으로 식품, 환경, 의료 등의 많은 분야에서 활용되고 있다. 이에 본 연구진은 예쁜꼬마선충을 이용한 나노재료의 독성검출 실험을 진행해 왔으며, 동시에 나노입자의 독성을 쉽고 빠르게 검출할 수 있는 방안을 모색해왔다. 그러던 중 예쁜꼬마선충과 미세유체 칩의 융합 연구 사례를 통해 특정 나노 물질에 노출된 예쁜꼬마선충의 거동을 미세유체 칩 안에서 확인할 수 있는 검출도구의 개발을 모색하게 되었다.

□ 연구 전개 과정에 대한 소개

소프트 리소그래피 방식으로 만든 미세유체 동물 칩을 제작하여, 내부 관과 배양공간에 은 나노 분산 용액을 채운 뒤에 예쁜꼬마선충을 일정시간 노출시켜 배양했다. 노출시간이 지난 후 내부 관에 선충을 고정시켜 몸길이, 두께, 이동 거리, 체내 유전자 발현(형광)을 대조군과 비교분석 했다. 이를 통해 예쁜꼬마선충과 미세유체 칩을 활용한 은 나노입자의 검출 및 독성 검출용 칩을 개발하게 되었다.

□ 연구하면서 어려웠던 점이나 장애요소가 있었다면 무엇인지? 어떻게 극복(해결)하였는지?

초기 실험단계에서 어려움을 겪었던 것은 예쁜꼬마선충을 위한 미세유체 칩의 디자인이었다. 최소한의 동작으로 최대의 효율을 낼 수 있는 도구의 개발을 목표로 했기 때문에, 칩의 제작과정 또한 최소한으로 줄일 수 있는 제작 방식에 초점을 맞춰 진행했다. 여러 디자인을 시도한 결과, 제작 및 사용이 가장 간단한 디자인을 적용할 수 있었다. 또한 미세유체 동물 칩을 제작하기 위해 필요한 기기들을 확보하기 위해서는 여러 분야의 연구실을 돌아다니며 도움을 얻었어야 하는 상황이었는데, 공동연구진의 도움으로 한 장소에서 계속해서 칩을 제작할 수 있게 되었다. 이를 통해서 칩 제작에 할애하던 시간을 줄이고 실험에 더 집중할 수 있었다.

□ 이번 성과, 무엇이 다른가?

이 연구를 통해 제작된 미세유체 동물 칩은, 기존에 보고된 적 없는 방법으로 은 나노입자와 같은 유해물질의 검출도구로 활용된 경우로, 나노입자의 검출을 비롯한 재료의 독성시험을 위해 필요한 시간과 노력 등을 단축함으로써 더 빠른, 나아가 실시간으로 모니터링이 가능한 검출도구 개발을 목표로 했다. 실험 결과로, 멀티 웰 플레이트 실험을 위해 사용한 예쁜꼬마선충의 5%에 해당하는 실험군과 대조군의 개체수로 미세유체 동물 칩에서 유의적인 나노입자 검출과 독성을 확인했다. 나아가 디자인 및 성능의 보완을 통해 상용 가능한 고효율의 검출 도구로의 개발을 제시한 것에 의의가 있다.

□ 꼭 이루고 싶은 목표와, 향후 연구계획은?

유해물질 검출 도구로서의 미세유체기반 예쁜꼬마선충 칩의 가능성을 확인한 연구로, 관련 기술을 더욱 발전시켜 보다 확실하고 유효한 비교검출이 가능한 성능의 칩 개발을 이루고자 한다. 이를 통해 식품, 환경, 의료 등 많은 산업적 및 학문적 분야에서 활용 가능한 유해물질 검출 도구 기술개발에 실질적인 기여가 되기를 희망한다.

□ 기타 특별한 에피소드가 있었다면?

미세유체 칩의 마스터는 감광액(SU-8)을 실리콘 웨이퍼 위에 고정시키는 작업으로 만들게 되며, 이는 작업시의 기술적 요인 외에도 습도 등의 외적 요인이 민감하게 작용하는데, 유독 미세유체 동물 칩의 마스터를 만들기 위한 작업을 하는 시기에 비가 많이 내렸다. 더욱이 작업 설비를 예약을 통해서만 사용이 가능한 상황이어서, 비가 오지 않는 날을 골라서 사용하기에도 무리가 있었다. 무더운 7월의 어느 날, 마지막 실험을 진행한 후에 유럽에서 열리는 국제학회 자료를 준비하고 있었다. 여름 장맛비가 내리던 날이었지만, 실험을 더 이상 미룰 수 없어서 작업을 진행했고, 아니나 다를까 마스터의 몰드가 너무 쉽게 떨어져 버려서 칩을 만들 수 없는 상황이 되었다. 공동연구팀의 판단과 도움으로 주말 시간을 이용하자는 의견을 나눴고, 감사하게도 다시 작업을 시작할 수 있었다. 다행스럽게도 당시에 만든 마스터를 이용하여 예정보다 많은 실험을 진행할 수 있었고, 유럽 학회에서 구두발표뿐만 아니라 논문 게재를 위한 연구진행에도 큰 도움이 되었다. 이 자리를 빌려 휴일에도 같이 연구를 위해 최선을 다해준 모든 연구팀에게 감사의 마음을 전한다.

용 어 설 명

１. 미세유체 칩 (microfluidic chip)
  ○ 인쇄, 스탬프, 몰딩과 같은 개념을 도입하여 기계적인 방법으로 마이크로 혹은 나노 단위를 구축하는 방법인 소프트 리소그래피를 사용하여 만들어진 마스터에 탄성중합체 (PDMS) 등을 부어서 제작하는 도구

２. 나노입자 (nanoparticle)
  ○ 보통 크기가 1~100nm의 크기를 이루는 입자
  ○ 나노는 1×10－9 m를 가리키는 길이 단위

３. 노출시간
  ○ 예쁜꼬마선충을 유해물질이 분산된 용액에 배양한 시간

４. 관 또는 채널
  ○ 미세유체 동물 칩 내부에서 유해물질 분산용액과 예쁜꼬마선충 등을 이동시키는 데 사용되는 이동부위로, 양 끝의 주입부와 유출부, 그리고 선충을 배양할 수 있는 공간을 연결

５. MTL-2 유전자 (metallothionein gene)
  ○ 세포질 안에 존재하는 특수한 금속단백질로, 중금속 등에 노출되는 경우에 유전자의 발현이 증가한다고 알려진 단백질

그 림 설 명

 

(그림 1) 미세유체 예쁜꼬마선충 칩을 이용한 나노입자 독성 검출 원리

         은 나노입자가 예쁜꼬마선충에 들어가면 선충의 몸체 길이와 두께가 줄고 이렇게 작아진 몸통 덕분에 폭이 좁아지는 채널에서 더 먼 거리를 진행할 수 있다. 또한 은 나노입자가 몸 안에 들어갔을 때, 특이적으로 많이 발현되는 유전자(mtl-2)에 형광 지표를 붙여 은 나노입자의 검출 그 독성 측정에 사용가능한 칩을 개발했다. 

(그림 ２) 미세유체 예쁜꼬마선충 칩에서 나노입자의 검출 및 독성 측정 

        미세유체 동물 칩을 사용하여 은 나노입자의 농도별 예쁜꼬마선충의 성장 저해를 확인하였다(a, b). 사선으로 좁아지는 칩 안의 채널에서 나노입자에 노출되어 몸체 크기가 성장하지 못한 실험군은 정상적으로 성장한 대조군에 비해 더 좁은 부분까지 이동하여 나아감으로써 나노입자의 노출과 독성을 육안으로 확인 가능케 하였다(c, d). 은 나노입자 체내 유입 시 특이적으로 mtl-2 유전자가 과대 발현하는 돌연변이 동물 개체를 활용하여, 나노입자가 존재 시에 이 유전자에 붙어 있는 형광 표지 단백질이 나노입자가 없는 대조군에 비해 녹색 더 밝고 선명하게 나타냄으로써 나노입자의 유무를 확인케 하였다.(e-g).