동물모델에서 항간암 효능 갖는 펩타이드 설계-c-Src와 결합, 종양 생성 촉진하는 TM4SF5 방해할 펩타이드 제안

동물모델에서 항간암 효능 갖는 펩타이드 설계-c-Src와 결합, 종양 생성 촉진하는 TM4SF5 방해할 펩타이드 제안

등록일2021.07.30.

 

 

 

동물모델에서 항간암 효능 갖는 펩타이드 설계 

c-Src와 결합, 종양 생성 촉진하는 TM4SF5 방해할 펩타이드 제안

  

   

□ 세포의 과다 증식과 이동을 촉발하는 종양단백질간의 결합을 방해할 펩타이드(작은 단백질 조각)가 소개됐다. 

 

□ 한국연구재단(이사장 노정혜)은 이정원 교수(서울대학교), 최선 교수(이화여자 대학교) 연구팀이 간암 등에 관여하는 대표적 종양단백질 c-SRC와 TM4SF5의 결합을 방해하기 위한 펩타이드를 제안했다고 밝혔다. 

     ※ TM4SF5(transmembrane 4 L six family member 5) : 세포막을 관통하는 단백질로 주로 정상 간보다 간암에서 발현이 높아지는 것으로 알려져 있다. 

 

□ 이 두 단백질의 결합은 세포의 증식이나 이동과 관련된 신호를 활성화 시켜 종양을 유발하는 것으로 잘 알려져 있었다. 

 ○ 특히 마땅한 억제제가 없고 메커니즘이 완전히 밝혀지지 않은 만성 간질환에서도 이들 단백질이 관여하는 것으로 알려져 있었다. 

 

□ 연구팀은 분자모델링과 돌연변이 연구를 통해 간암에서 많이 발현되는 세포막 단백질 TM4SF5이 종양단백질 c-Src와 결합하는 부위를 상세히 밝혀냈다. 

 ○ TM4SF5의 C-꼬리 부위(C-terminus)가 세포질에 존재하는 불활성 화된 c-Src와 결합하여 c-SRC를 세포막으로 데려오고 여기에 탈인산화효소까지 결합하여 c-SRC를 활성화시키는 기전을 제시 하였다.

 

□ 나아가 이를 토대로 두 종양단백질의 결합을 막을 수 있도록 TM4SF5의 C-꼬리 부위를 닮은 펩타이드 조각을 설계했다.

 ○ 실제 TM4SF5와 경쟁, c-SRC를 낚아챔으로써 두 종양 단백질의 결합을 저지하길 기대한 것이다. 특히 세포침투를 돕는 바이러스 펩타이드 서열을 포함시켜 실질적 경쟁이 이뤄지도록 했다. 

 

□ 실제 이 펩타이드 조각을 종양 생쥐모델 및 폐로의 전이암 형성이 유발되는 동물모델에 넣어준 결과 암 형성 및 폐로의 전이정도가 대조군에 비해 저하되는 것을 확인하였다. 

 

□ 분자모델링과 돌연변이 연구를 통해 종양단백질 상호작용 부위을 상세히 규명함으로써 이같은 상호작용을 저지할 수 있는 억제제 개발의 단초가 될 것으로 기대된다. 

 

□ 과학기술정보통신부와 한국연구재단이 추진하는 중견연구사업, 선도연구센터사업, 바이오·의료기술개발사업 및 국가슈퍼컴퓨팅센터의 지원으로 수행된 이번 연구의 성과는 의학 분야 국제학술지 ‘Theranostics’에 7월 6일 게재되었다.

 

 

주요내용 설명

 

 <작성 : 이정원 서울대학교 약대 교수/최선 이화여자대학교 약대 교수>

 

논문명

N-terminus-independent activation of c-Src via binding to a tetraspan (in) TM4SF5 in hepatocellular carcinoma is abolished by the TM4SF5 C-terminal peptide application

저널명 

Theranostics

키워드 

c-Src, metastasis(전이), protein-protein interaction(단백질-단백질 상호작용), PTPIB, TM4SF5

DOI

10.7150/thno.58739

저  자

이정원 교수(교신저자/서울대학교), 최선 교수(교신저자/이화여자대학교)

송행은 석사(제1저자/서울대학교), 이윤지 교수(제1저자/중앙대학교), 김은미 박사(제1저자/서울대학교)

 

 

1. 연구의 필요성

 ○ 간암은 한국인을 포함한 동양인에게서 발병률이 높고 생존율이 2019년 기준으로 37%에 이르는 난치암 중의 하나이다. 이러한 간 질환은 만성적 질환으로서 우리나라 경제활동의 주역인 40~50대 국민의 가장 높은 의료비용의 원인이 되고 있으며 마땅한 억제제가 없는 상황이다. 

 ○ 간암 발병에 대해서는 지방간/지방간염의 단계에서 간 섬유화/경화를 거쳐 암으로 심화된다고 알려졌지만, 정확한 메커니즘 규명과 더불어 효과적 치료제 개발이 절실히 필요하다. 

 ○ 본 연구팀은 지난 20여 년 동안 TM4SF5(transmembrane 4 L six family member 5) 라는 세포막 단백질과 간 질환과의 연관성에 대해 지속적으로 연구해 왔다. 특히 최근 연구결과를 통해 TM4SF5가 정상 간에서는 발현이 미미 하다가, 염증 등을 동반하는 대사 및 염증의 비정상적 질환 환경 및 단계에서 발현이 증가하면서, 지방간/지방간염(non-alcoholic steatohepatitis, NASH)의 발병과 간암의 발병에 중요한 역할을 하는 것을 규명 하였다 (Journal of Pathology 2021, Cell Metabolism 2019). 

 

2. 연구내용 

 ○ 본 연구에서는 TM4SF5와의 결합에 의한 인산화효소 c-Src의 활성화가 간 섬유화 및 간암 발병 및 전이 기전에 중요함을 규명 하였다. 

 ○ 세포막 단백질인 TM4SF5의 C-꼬리 부위(C-terminus)가 c-Src의 인산화 효소 도메인인 SH1 도메인과 결합하여 (타이로신 530이 인산화되어) 불활성화되어 있던 c-Src를 세포막 부위로 불러들이고, 여기에 탈인산화 효소 PTP1B가 결합하여 (타이로신 530의) 탈인산화를 통해 c-Src를 활성화시키는 기전을 제시하였다.

 ○ c-Src는 여러 종류의 암 종에서 활성화되기에 종양유전자로서 매우 중요한 요소이며, 이에 대한 적절한 제어는 유망한 항암전략으로 여겨진다. 본 연구를 통해 세포막에 스스로 다가갈 수 없는 불활성화된 c-Src 형태라 할지라도, TM4SF5와의 결합에 의해 세포막 에서 활성화되는 새로운 기전을 확인한 것이 본 연구의 차별적 특정으로 여겨진다.

 ○ 또한 TM4SF5와 c-Src의 결합을 방해하는 TM4SF5의 C-꼬리 부위에 해당하는 펩타이드를 세포 내부로 침투하기 쉽게 한 형태로 처리함으로써, 간암 발병 및 암전이를 효과적으로 조절할 수 있음을 확인하였고, 돌연변이 분석 및 구조 모델링을 통하여 TM4SF5와 c-Src의 결합 기전을 원자 수준에서 규명하였다. 

 ○ 연구팀은 이번 연구에서 c-Src의 N-꼬리 부위가 없어도 SH1 도메인과 결합하는 막단백질 TM4SF5에 의해 세포막에 근접할 수 있음을 확인했다. 이때, TM4SF5에 의해 선호되는 c-Src는 비활성화된(즉, 타이로신 530번이 인산화되어 비활성화된) 형태의 효소가 결합하게 되고, 추가적으로 TM4SF5가 탈인산화효소 PTP1B와 결합하여 3중 결합체를 형성한다. 이 PTP1B는 c-SRC의 타이로신 530번을 탈인산화시켜 구조변화를 유도하여 활성화되도록 한다. 

 ○ 이렇게 활성화된 c-Src는 TM4SF5의 다른 부위(TM4SF5의 세포막 관통 도메인 2번과 3번 사이의 intracellular loop)에 결합하는 FAK 효소를 활성화하기도 한다. 이로써 활성화된 c-Src는 직접 혹은 FAK을 통하여 간암의 형성과 전이에 중요히 작용한다는 것을 확인하였다.

 ○ 이 과정에서 c-Src와 TM4SF5의 결합에서 중요한 역할을 하는 부위 및 아미노산도 알아냈다. 돌연변이들을 제작하여 그들의 활성을 분석하고, 또한 단백질 분자모델링의 연구방법을 통하여 TM4SF5와 c-Src의 결합을 위해, TM4SF5는 2번째 세포 외부의 루프 loop (extracellular loop 2)부터 C-꼬리 부위에 이르는 부위가 중요하다는 것을 밝혔다. 

 ○ 특히 TM4SF5의 D188(188번 아스파르트산), C189(189번 시스테인), R190 (190번 아르기닌) 아미노산이 결정적으로 중요하며, c-Src의 측면에서는 SH1 인산화 도메인의 K254(254번 라이신), D457(457번 아스파르트산), G462(462번 글루타민), 및 R463(463번 아르기닌)이 결합에 중요하게 관여함을 밝혔다.

 ○ 이러한 정보를 토대로 두 단백질 간의 상호 결합 및 작용을 막을 수 있는 펩타이드를 설계하여, 그 둘의 결합을 방해함으로써, c-Src의 활성화가 불가능하게 시도하였다.

 ○ 즉, TM4SF5의 C-꼬리 부위에 해당하는 펩타이드를 TAT라고 하는 바이러스의 단백질(세포 침투 및 감염에 역할 하는 단백질)의 아미노산 서열들과 결부시키고, 그 사이에 세포막에 잘 위치하도록 하는 CAAX라고 하는 아미노산 서열 조각을 합쳐서 합성 제작하였다. 

 ○ 이 펩타이드를 세포 및 동물모델에 주사 처리함으로써, 대조군 펩타이드에 대비하여, 세포에서는 TM4SF5와 c-Src의 결합 및 c-Src의 활성화가 억제되고, 동물모델에서는 간암의 형성과 전이가 억제됨을 확인할 수 있었다.

 

3. 기대효과

 ○ 단백질-단백질 결합 억제제의 개발에서 분자모델링의 전략과 더불어 생화학적/세포생물학적 연구접근법을 활용하는 다학제적 연구결과를 통해 TM4SF5 및 c-Src의 신호전달 활성화에 따른 간 섬유화 및 간암의 발병 기전을 규명하였다. 

 ○ TM4SF5와 c-Src의 결합을 막아 c-Src 활성화를 제어할 수 있는 펩타이드 개발의 단서를 확보함으로써, 중요한 간암을 포함하는 간 질환 제어 가능 바이오의약품 개발의 근거를 마련하였다. 

 

그림 설명

 

 

 

 

(그림1) TM4SF5 결합에 의한 종양단백질 c-Src 활성화 상세 기전 규명 

(왼쪽) 세포막에 존재하는 TM4SF5 단백질의 세포 내부 loop에 FAK이 결합하고 C-꼬리 부위에 타이로신 530이 인산화되어 불활성화된 c-Src가 접근할 수 있는 모습

(오른쪽) TM4SF5의 C-꼬리 부위에 불활성화된 c-Src가 접근하여 결합하였을 때, PTP1B도 결합하게 되어 타이로신 530을 탈인산화 시킴에 따라, c-Src는 구조변화를 일으키고 활성화되는 모습 (오른쪽 아래). 활성화된 c-Src는 또한 세포 내부 loop에 결합한 FAK을 인산화/활성화시킬 수 있음으로써, c-Src 자신 스스로 혹은 FAK/paxillin과 신호연계를 통하여 종양형성 및 암전이 기능을 향상시킬 수 있음.

 

그림설명 및 그림제공 : 서울대학교 이정원 교수 

 

 

 

 

 

(그림2) 세포막단백질 TM4SF5와 세포질단백질 c-Src의 결합모델

(왼쪽) 세포막에 위치한 TM4SF5와 세포질에 자리잡은 c-Src의 결합 구조를 분자모델링을 통해 예측한 모델. 

(오른쪽 위) 결합모델을 바탕으로 두 단백질의 상호작용에 중요한 아미노산 잔기들을 예측하였으며, 해당 잔기들의 역할을 돌연변이 분석을 통해 실험적으로 검증함. 

(오른쪽 아래) 역동적인 단백질의 움직임을 시뮬레이션 함으로써 단백질 상호작용 메커니즘을 원자 수준에서 제시하였음 

그림설명 및 그림제공 : 이화여자대학교 약학대학 최선 교수 

 

 

 

 

 

연구 이야기

 

                                          <작성 : 서울대학교 이정원 교수>

□ 연구를 시작한 계기나 배경은? 

 

TM4SF5가 197개의 비교적 적은 수의 아미노산으로 이루어지고 세포막을 4번씩이나 통과하는 막단백질이지만, 세포 외부 노출 부위 뿐 아니라, 세포 내부로 노출된 부위가 비교적 적으면서도 중요한 세포 내외부 단백질들과 결합하여 신호전달 과정들의 활성을 초래하는 것으로 파악되어 왔다. 이에 비교적 짧은 C-꼬리 부위(C-Terminus)가 어떻게 세포 내부의 신호전달 활성과 연계되는지, 그리고 이러한 측면이 어떻게 간암을 포함하는 간 질환 유발로 이어지는지 기전적으로 규명하고자 하였다. 

 

 

□ 연구 전개 과정에 대한 소개

 

2012년 석사과정 학생의 논문 연구주제로 시작되었다. 의미 있는 결과들이 많이 도출되어 연구를 보다 심화시키고자 동물모델 연구 및 분자모델링 연구에 추가하여 펩타이드 약물 연구를 추가하여 결실을 얻게 되었다. 

 

 

□ 연구하면서 어려웠던 점이나 장애요소는 무엇인지? 어떻게 극복(해결)하였는지?

 

석사과정 연구주제로 출발한 만큼 주제를 더 확장하고 내용을 보강하는 과정에서 여러 연구원이 참여하였고 시간이 더 소요된 만큼 항상 무거운 마음이었다. 연구 초기 중요 연구내용에 대한 특허를 출원하여, 심사등록 과정에서 일부 연구내용이 학술대회에서의 초록 발표가 온라인으로 남아있었던 바에 의해 특허 청구항이 대거 삭제되는 상황도 있어 아쉬움이 있었다.

 

 

□ 이번 성과, 무엇이 다른가? 

 

다양한 암종에서 중요한 암유전자로서 c-Src의 활성화를 설명하는 내용 중에서도, 특히 c-Src의 세포막 근접에 따른 활성화 기전이 또 다른 식으로 설명되는 것이었다. 즉 c-Src 자체에 세포막에 위치할 수 있는 수단(지방분자들과의 연결)이 없을 때도, 세포막 단백질인 TM4SF5의 결합을 통하여 세포막에서 활성화가 초래될 수 있는 것이 새로운 측면이다.

 

 

□ 실용화된다면 어떻게 활용될 수 있나? 실용화를 위한 과제는?

 

암유전자 c-Src의 활성화 기전을 TM4SF5와의 결합에 의해 유발되는 것을 밝혔고, 또 그 결합을 저해할 수 있는 세포 침투성을 가질 수 있도록 한 TM4SF5의 C-꼬리 부위에 해당하는 펩타이드를 간암 억제 가능 약물로 개발을 위한 가능성을 확인한 연구결과이다.

 

 

□ 꼭 이루고 싶은 목표나 후속 연구계획은? 

 

TM4SF5가 다양한 단백질들과 결합하여 간 질환 및 간암 발병에 중요한 역할을 하므로, 그 TM4SF5의 구조적 의미를 질환과 연결하는 연구 및 그들을 제어할 수 있는 연구에 좀 더 집중하고자 한다.