단백질 코로나, 알츠하이머 치료제 개발 도울 실마리 찾아-아밀로이드 올리고머 표적 고효율 약물 스크리닝 기술 개발

단백질 코로나, 알츠하이머 치료제 개발 도울 실마리 찾아-아밀로이드 올리고머 표적 고효율 약물 스크리닝 기술 개발

 

등록일 2021.01.29.

 

단백질 코로나, 알츠하이머 치료제 개발 도울 실마리 찾아
아밀로이드 올리고머 표적 고효율 약물 스크리닝 기술 개발

□ 알츠하이머병의 원인으로 밝혀진 아밀로이드 베타(Amyloid-β, Aβ) 올리고머를 나노입자 표면에 합성하고 이를 이용해 아밀로이드 베타 올리고머를 분해하는 화합물이나 생체단백질을 빠르게 발굴할 수 있는 길이 열렸다.

□ 한국연구재단(이사장 노정혜)은 윤대성 교수(고려대학교) 연구팀이 이정훈 교수(광운대학교), 이규도 교수(고려대학교), 황교선 교수(경희대학교)와 공동으로 나노입자 표면에 단백질 코로나 형태로 아밀로이드 베타 올리고머를 합성, 수많은 화합물 가운데 올리고머만 선택적으로 분해하는 화합물을 탐색(스크리닝)할 수 있는 플랫폼을 개발했다고 밝혔다.
※ 단백질 코로나(protein corona) : 마치 태양의 코로나처럼 단백질들이 나노입자 표면에 응집해 이룬 응집체를 뜻함. 태양의 상층부 대기를 뜻하는 코로나는 태양 주변으로 뻗어 나오는 형상이 왕관(corona)을 닮았다 하여 붙여진 이름.

□ 화합물을 탐색하는 데 걸리는 시간을 기존 수 일에서 하루 이내(3~6 시간)로 단축, 알츠하이머 치료제 후보물질 발굴이 활발해질 것으로 기대된다. 고가인 아밀로이드 베타를 아주 조금(기존 대비 50배 이하)만 사용해도 되는 것도 장점이다.
□ 현재 알츠하이머병의 주요 원인물질로 아밀로이드 베타 플라크에서 아밀로이드 베타 올리고머로 초점이 맞춰지고 있다.
○ 하지만 순수한 올리고머 합성과 정제가 어려운데다 올리고머를 표지할 수 있는 형광물질도 없어 이를 표적으로 하는 약물 후보물질을 대량으로 탐색하기가 쉽지 않았다.

□ 연구팀은 플라즈모닉 나노입자 표면에 단백질 코로나 형태로 순수한 아밀로이드 베타 올리고머 만을 코팅하는데 성공하였으며, 후보화합물에 의해 단백질 코로나가 분해될 시 나노입자 표면이 노출, 나노입자가 서로 응집하여 흡광도 변화를 유도, 용액이 적색으로 변하는 원리를 이용하여 약물탐색 플랫폼을 개발했다.
※ 플라즈모닉 나노입자 : 국소 표면 플라즈몬 공명 현상을 띄는 금속나노입자
※ 국소화 표면 플라즈모닉 현상 : 금속 나노입자와 빛이 반응하여 일어나는 광학적 특성. 나노입자의 크기 및 구조에 따라서 독특한 흡광특성을 나타냄

□ 형광물질이나 추적을 위한 추가적인 처리 없이 용액의 색 변화로 올리고머를 선택적으로 분해하는 화합물이나 생체단백질을 선별할 수 있도록 한 것이다.

□ 실제 알츠하이머 완화에 도움이 된다고 알려진 저분자 화학물질 6종 및 생체 내 아밀로이드 베타를 제거하는 생체단백질 2종을 이용해 이 플랫폼을 검증하였다.

□ 과학기술정보통신부와 한국연구재단이 추진하는 중견연구사업, 원천기술개발사업 및 4단계 BK21 사업 등의 지원으로 수행된 이번 연구의 성과는 국제학술지 ‘네이처 커뮤니케이션즈(Nature Communications)’에 1월 27일 게재되었다.

주요내용 설명

논문명
Plasmonic nanoparticle amyloid corona for screening Aβ oligomeric aggregate-degrading drugs
저널명
Nature Communications
키워드
알츠하이머 병, 아밀로이드 베타, 단백질 코로나, 약물 스크리닝
저 자
윤대성 교수 (고려대, 교신저자), 이규도 교수 (고려대, 교신저자) 이정훈 교수 (고려대, 교신저자, 이동택 박사과정 (고려대, 1저자), 박동성 박사과정 (고려대), 이상원 박사 (고려대), 이원석 박사 (고려대), 황교선 교수 (경희대)

<작성 : 고려대학교 윤대성 교수>
1. 연구의 필요성
○ 지난 수십 년간 많은 다국적 기업이 개발하고자 한 약물은 아밀로이드 베타(Aβ) 피브릴 또는 플라크를 표적으로 하였음. 하지만 이를 표적으로 한 약물개발의 성과는 천문학적 수준의 시간과 비용의 투자에도 불구하고 미비함.
※ 알츠하이머 : 치매의 약 70%를 차지하는 가장 흔한 퇴행성 뇌질환. 기존 가설은 신경퇴화 및 유전적인 요인들에 의해 비정상적으로 축적된 플라크가 원인 물질로 알려졌다.
※ 아밀로이드 베타(Amyloid-β) : 알츠하이머 환자의 뇌에서 발견되는 플라크의 주성분 단백질. 최근 아밀로이드 베타 올리고머가 신경세포 독성을 나타낸다는 것이 알려져 있다.
○ 현재 다양한 연구들이 아밀로이드 베타 피브릴 또는 플라크가 아닌 아밀로이드 베타 올리고머를 세포 독성, 시냅스 붕괴 및 타우(Tau) 단백질의 인산화 유발 등의 이유로 알츠하이머병의 주요 원인 물질로 지목하고 있음.
※ Aβ 단량체 : Aβ 단일펩타이드 형태의 단백질
※ Aβ 올리고머 : 2개 이상의 적은 개수의 Aβ 단량체가 응집이 되어 형성되는 응집체
○ 하지만 순수 아밀로이드 베타 올리고머의 합성과 정제의 어려움 및 특이적 형광표지의 부재 등을 이유로 아밀로이드 베타 올리고머 분해약물 스크리닝 기술에 대한 연구가 미비한 상황임.

 

2. 연구내용
○ 플라즈모닉 나노입자 표면에 아밀로이드 베타 (Aβ) 단량체를 증착시키고 나노입자의 촉매적 특성을 이용하여 아밀로이드 단백질 코로나 형태로 나노입자 표면에 형성됨을 확인함. (그림 1)
※ 국소화 표면 플라즈모닉 현상 : 금속 나노입자와 빛이 반응하여 일어나는 광학적 특성. 나노입자의 크기 및 구조에 따라서 독특한 흡광특성을 나타냄
※ 아밀로이드 단백질 코로나 : 아밀로이드 단백질이 나노입자 표면에 코팅되어 형성된 단백질층
○ 나노입자 표면을 감싼 아밀로이드 코로나가 후보화합물에 의해 분해되면 금 나노입자 표면이 드러나고 입체적 안정성(steric stabiliization)이 낮아지면서 입자끼리 응집됨. 이로 인해 나노입자 사이 전기적인 반발력이 사라져 서로 뭉치게 되고 용액의 흡광도가 적색이동(red shift)를 하게 되는 현상을 이용함.
○ 나노입자 표면의 아밀로이드 코로나의 구성을 검증하기 위해 항체 - 그래핀 기반의 바이오센서를 이용함. 그 결과 플라즈모닉 나노입자 표면의 아밀로이드 코로나가 알츠하이머병의 주요 원인 물질인 Aβ올리고머임을 확인함. (그림 2)
○ 합성된 플라즈모닉 나노입자 기반 아밀로이드 코로나를 이용하여 단백질 기반 효소(Protease XIV 및 Matrix metallopeptidase 9, MMP-9)의 Aβ 올리고머 분해효능을 정량적으로 분석하였음 (그림 3). 특히, MMP-9의 경우 Aβ 올리고머의 구성 성분이 Aβ(1-42) 또는 Aβ(1-40)에 따라 분해 활성이 극명하게 다름을 규명하고 10 fg/ml 수준의 극저농도 효소활성을 검출할 수 있음을 확인
○ 또한 플라즈모닉 나노입자기반 아밀로이드 코로나를 이용하여 알츠 하이머를 치료하는데 도움이 된다고 알려진 저분자 화학물질들의 Aβ 올리고머 분해효과를 정량적으로 분석함(그림 4). 이에 대한 결과는 전기영동, 투과전자현미경(TEM) 및 극저온 투과전자현미경 (Cryo-TEM) 등을 통해서 교차 검증함
○ 그래핀 전계효과 트랜지스터에 Aβ 형태 특이적 항체를 부착하여 아밀로이드 코로나와 반응시킴으로서, 플라즈모닉 나노입자 표면에 생성된 코로나 단백질이 Aβ 올리고머 형태임을 교차확인했다.
※ 그래핀 전계효과 트랜지스터 : 소스와 드래인 사이의 전자의 흐름을 게이트 전극을 이용하여 제어하는 트랜지스터의 한 유형. 본 소자의 경우 게이트전극을 그래핀 나노소재를 이용하여 구성하였고, 각 소자의 그래핀전극 위에 Aβ단량체, 올리고머, 피브릴을 각각 인식할 수 있는 고유의 항체를 고정화함
※ 단백질 코로나 (protein corona) : 나노입자 들이 단백질들과 상호작용을 하여 단백질들이 ‘태양의 코로나 현상’과 닮은 형태로 입자표면으로 응집하는 현상 및 그 단백질응집체를 뜻함

3. 연구성과/기대효과
○ Aβ 아밀로이드 단백질을 플라즈모닉 나노입자 표면에 코로나 형태로 합성하고 이를 이용하여 in vitro 약물 스크리닝 플랫폼을 제시함.
○ 기존의 Aβ 피브릴 또는 플라크로 응집되는 것을 억제하는 양상을 모니터링하는 기존의 스크리닝 방식에 비해, 개발된 약물스크리닝 플랫폼을 이용할 경우 알츠하이머의 주원인 물질로 주목받는 Aβ 올리고머에 대한 특이적인 약물 후보군을 발굴하는 것이 가능해 짐.
○ 추가적인 처리과정 (예: 형광 (ThT, Congo red 등) 표지) 이 불필요 하며, 매우 고가인 Aβ를 극소량 (약 50배 이하) 사용함으로서 경제적임. 384 well-plate 기반의 고효율 약물 스크리닝이 가능하여 약물 발굴에 걸리는 시간과 비용을 획기적으로 감소시킬 수 있을 것이라 전망함.

그림 설명

 

Figures are reproduced with permission from Lee at el. 2021, © 2021 Nature Publishing Group.

(그림 1) 플라즈모닉 나노입자 아밀로이드 코로나 (PNAC)을 이용한 비색법 약물 스크리닝. (a) PNAC의 복합체 형성 과정. (b, c) 형성과정의 TEM 이미지. (d) 약물 처리에 따른 아밀로이드 코로나의 분해 양상 Cryo-TEM 이미지. (e) PNAC을 이용한 비색법 약물 스크리닝.
플라즈모닉 나노입자를 기반으로 하여, 아밀로이드 베타 (Amyloid-β, Aβ)를 증착시켜 단백질 코로나 형태로 플라즈모닉 나노입자 아밀로이드 코로나 (PNAC)을 합성함. 이 기술은 나노입자 응집에 의한 국소 플라즈몬 공명 (Localized surface plasmon resonance, LSPR) 현상을 기반으로 하여 용액의 색 변화를 통해 (비색법) 약물의 효능을 정량적으로 평가하는 기술임.
그림 및 그림설명 제공 : 고려대학교 윤대성/이동택

Figures are reproduced with permission from Lee at el. 2021, © 2021 Nature Publishing Group.

(그림 2) PNAC 표면의 아밀로이드 코로나 형태분석. (a, b) 그래핀-항체 바이오센서를 이용한 아밀로이드 코로나 구성 검증. (c) PNAC의 표면전하 및 크기 분석. (d) XPS를 이용한 PNAC의 성분 분석. (e) PNAC의 동결-건조 테스트 결과
PNAC 표면에 존재하는 아밀로이드 코로나의 형태적 특성을 파악하기 위해 그래핀-항체 바이오센서를 이용함. Aβ 특이적 6E10 항체, 올리고머 특이적 A11 항체 및 피브릴 특이적 항체 OC를 통해서 아밀로이드 코로나의 형태적 특성을 알츠하이머의 주 원인 물질로 알려진 Aβ 올리고머임을 검증함. 또한, 다양한 생화학적 검증 방식을 통해 균일한 아밀로이드 코로나가 PNAC 표면에 형성됨을 확인함.
그림 및 그림설명 제공 : 고려대학교 윤대성/이동택

 

 

 

 

Figures are reproduced with permission from Lee at el. 2021, © 2021 Nature Publishing Group.

(그림 3) PNAC을 이용한 다양한 단백질 분해 효소의 Aβ 분해기작 검증
Aβ를 분해할 수 있는 단백질 효소로 알려진 Protease XIV와 Metrix metallopeptidase 9 (MMP-9)을 통해 Aβ 올리고머 분해 효능을 정량적으로 분석함. 특히, MMP-9의 경우는 Aβ의 구성의 종류 (Aβ(1-42) 또는 Aβ (1-40)에 따라 분해 활성이 극명히 다름을 규명함. 또한, 효소 활성을 극저농도 (10 fg/ml) 수준에서 검출이 가능함을 확인함.
그림 및 그림설명 제공 : 고려대학교 윤대성/이동택

Figures are reproduced with permission from Lee at el. 2021, © 2021 Nature Publishing Group.

(그림 4) 비색법 약물 스크리닝 기술을 이용한 다양한 저분자 물질들을 이용한 검증 (a-e) EGCG, curcumin, glutathione, rutin 그리고 tramiprosate 처리에 따른 PNAC의 흡광도 변화, (f) 용량-반응 관계 (dose-response relationship)로 모델링한 각각의 약물의 분해효과 정량화 (g) 이에 따른 파라미터 (Hillslope, ECG50, Maximal Efficacy), (h) Max efficacy/EC50으로 나타낸 각각의 약물의 아밀로이드 분해 효능
PNAC을 이용하여 알츠하이머 치료에 도움이 된다고 알려진 저분자 물질들의 Aβ 올리고머 분해효과를 정량적으로 분석함. 이런 분석결과들을 바탕으로 본 연구팀이 개발한 약물 스크리닝 플랫폼은 알츠하이머 주 원인물질로 알려진 Aβ 올리고머 제거할 수 있는 약물을 발굴하는데 활용할 수 있음을 검증함
그림 및 그림설명 제공 : 고려대학교 윤대성/이동택

연구 이야기

<작성 : 고려대학교 윤대성 교수>

□ 연구를 시작한 계기나 배경은?

수 십 년 동안 세계 유수의 제약회사에서 Aβ(아밀로이드 베타)를 표적으로 하는 알츠하이머 치료제를 개발하려는 활발한 움직임이 있었으나 대부분 실패하였다. 실패의 가장 큰 이유 중 한 가지는 치료제 후보 약물들이 Aβ 올리고머에 대한 특이성이 낮다는 점이었다. 따라서 Aβ 올리고머에 대한 특이성이 높은 화합물들을 스크리닝 할 수 있는 플랫폼 개발에 대한 아이디어를 떠올렸다. 이를 실현시키기 위해 우선 플라즈모닉 나노입자의 촉매적 특성을 이용하여 단백질 코로나-나노입자 복합체 (plasmonic nanoparticle amyloid corona, PNAC)을 얻는데 성공하였고, 약물에 따른 단백질코로나-나노입자 복합체의 광학적 특성변화가 관찰되었다. 이러한 발견이 본 연구를 본격적으로 시작하게 된 계기가 되었다.

 

□ 연구 전개 과정에 대한 소개

박사과정인 이동택 학생은 다양한 나노입자 및 아밀로이드 합성에 대해 지속적인 연구를 진행해 왔었다. 특히 나노입자와 아밀로이드 단백질의 상호작용에 대해서 다양한 시도를 한 끝에 단백질 코로나-나노입자 복합체를 합성하는데 성공하였다. 새로운 물질인 단백질코로나-나노입자 복합체에 대한 어플리케이션에 대해서 의학, 생명과학 및 공학적인 관점으로 다양한 논의를 한 끝에 나노입자의 광학적 특성을 이용한 알츠하이머 치료제 발굴이라는 주제를 발견하게 됐다.

 

□ 연구하면서 어려웠던 점이나 장애요소는 무엇인지? 어떻게 극복(해결)하였는지?

플라즈모닉 나노입자의 퀀칭 효과 때문에 합성된 단백질코로나의 주 성분이 아밀로이드 베타 올리고머임을 증명하는데 어려움이 있었다. 이를 극복하기 위해 경희대학교 의과대학 황교선 교수팀과 연계하여 그래핀 전계효과 트랜지스터에 아밀로이드 베타 형태 특이적 항체를 부착하는 방식으로 단백질코로나의 주 성분을 확인하였다. 또한 이규도 및 이정훈 교수팀과 연계 연구로 크고 작은 문제점들을 함께 극복했다.

□ 이번 성과, 무엇이 다른가?

기존에 보고된 나노입자를 활용한 알츠하이머 약물스크리닝 방식은 아밀로이드 베타 단량체가 응집이 되는 것을 억제하는 약물을 발굴하는 방식이었으며, 이는 치료제의 개념과는 거리가 있는 방식이다. 또한 많은 경우에 세포실험과 알츠하이머 쥐 실험을 통하여 약물의 효능을 검증하지만 이는 많은 시간과 비용이 소요된다는 단점이 있다. 이번에 개발된 약물스크리닝 플랫폼은 순수 아밀로이드 베타 올리고머로 이루어진 코로나단백질 복합체로서 알츠하이머의 직접적인 원인물질인 아밀로이드 베타올리고머의 분해양상을 정량적으로 신속하게 분석할 수 있는 플랫폼이다. 기존에 스크리닝에 비해서 매우 고가인 아밀로이드 베타를 극소량(50배 이하) 사용하기 때문에 매우 경제적이며 정확하고 신속하게 약물후보물질로서 화합물을 스크리닝할 수 있다.

 

□ 실용화된다면 어떻게 활용될 수 있나? 실용화를 위한 과제는?

본 연구팀이 개발한 약물후보물질 스크리닝 플랫폼을 이용할 시 알츠하이머 주요 표적 단백질을 표적하기 때문에 임상시험 통과의 가능성이 높은 아밀로이드 베타 올리고머 특이적 화합물을 발굴 할 수 있을 것이라 사료된다. 하지만 실질적인 약물 발굴을 위해서는 고가의 장비와 수 만 가지 이상의 화학물질 라이브러리를 구축해야 한다. 또한, 수 만 가지 약물 후보군을 스크리닝하기 위해서는, 단백질코로나-나노입자 복합체를 대량으로 합성하는 기술도 요구된다. 본 연구팀은 다양한 연구팀 및 관련 회사와 지속적이고 빈번한 교류를 통해 실용화를 위한 과제를 극복할 예정이다.

 

□ 꼭 이루고 싶은 목표나 후속 연구계획은?

개발된 알츠하이머 약물스크리닝 플렛폼을 이용하여 본격적인 약물발굴연구를 진행할 계획이다. 최근 들어 알츠하이머 발병의 원인이 아밀로이드 베타 올리고머 뿐만 아니라 타우단백질의 올리고머 형태도 주된 원인이라는 것이 규명되었다. 현재 본 연구실에서는 타우단백질 올리고머로 이루어진 코로나복합체의 합성에도 성공한 상황이다. 이 두 스크리닝 플랫폼을 활용하여 아밀로이드 베타 올리고머와 타우 올리고머를 동시 타겟하는 약물 혹은 약물조합을 발굴하고자 한다. 발굴된 약물후보군에서 전임상시험 및 임상시험을 통하여 유력한 알츠하이머 치료제를 개발하는 것이 꼭 이루고 싶은 목표이다.