아데닌 염기만 찝어 바꾸는 염기교정 가위 정확성 밝혀- IBS, 절단 유전체 시퀀싱 기법 활용 … 인간 유전체 32억 개 중 평균 60곳 변이

아데닌 염기만 찝어 바꾸는 염기교정 가위 정확성 밝혀- IBS, 절단 유전체 시퀀싱 기법 활용 … 인간 유전체 32억 개 중 평균 60곳 변이

 

보도일2019-03-05 01:00

 

 

 

아데닌 염기만 찝어 바꾸는 염기교정 가위 정확성 밝혀
- IBS, 절단 유전체 시퀀싱 기법 활용 … 인간 유전체 32억 개 중 평균 60곳 변이 -

 최신 유전자 교정기법인 염기교정 가위(Base Editor) 염기교정 유전자가위(Base Editor, targeted deaminase): 2016년 데이비드 리우(David R. Liu) 교수 연구그룹(하버드대학)과 케이지 니시다(Keiji Nishida) 교수와 동료들(고베 대학교)이 각각 개발한 인공제한 효소로 세포 수준에 적용한 바 있다. 염기교정 유전자가위는 DNA 두 가닥 모두를 자르는 기존의 3세대  유전자가위인 크리스퍼 Cas9 혹은 Cpf1에 비해 보다 효율적으로 단일 염기 하나만 바꿀 수 있다는 특징이 있다.
를 한 단계 더 발전시킬 방법이 나왔다. 기초과학연구원(IBS, 원장 김두철) 유전체 교정 연구단은 DNA 염기 중 아데닌 염기만 바꾸는 아데닌 염기교정 유전자가위(Adenine Base Editor, 이하 아데닌 염기교정 가위)’의 정확성을 규명하고, 이를 증대시킬 방법을 국제 학술지 네이처 바이오테크놀로지(Nature Biotechnology)에 소개했다.
 생명체에 관한 모든 정보를 담은 DNA는 네 개의 염기가 서로 쌍(아데닌(A)-티민(T), 시토신(C)-구아닌(G))을 이뤄 만든 서열로 구성되어 있다. 염기교정 가위는 단일 염기 하나만을 바꿀 수 있는 인공제한 효소로 2017년 학계에 보고된 아데닌 염기교정 가위는 아데닌(A)을 구아닌(G)으로 바꿀 수 있다. 2017년 학계에 보고된 아데닌 염기교정 유전자가위는 DNA의 한 쪽 가닥을 자르는 Nickase Cas9(nCas9)과 시토신을 분해하는 아데닌을 가수분해하는 아데닌 탈아미노효소(adenine deaminase)로 구성되어 있다. nCas9으로 잘려진 DNA 한 가닥에서 아데닌 탈아미노효소가 아데닌(C)을 이노신(I)로 바꾸면, 우라실(U)로 바뀐 염기는 DNA 복구 과정에 의해 구아닌(G)이 되는 원리로 작동한다.

 염기교정 가위는 난치성 유전질환 연구와 치료에 진전을 가져올 도구로 주목받고 있다. 대부분의 유전질환이 단일 염기의 문제로 발생하기 때문에 발병기전이나 치료법 개발에 큰 도움이 될 것으로 기대되나 유전자 교정기법으로 활용되려면 정확성 규명이 선행되어야만 한다. 표적 위치에서 정확하게 작동하는지, 의도치 않은 곳에서 오작동하지 않는지 확인하고, 정확성을 개선하는 연구가 뒷받침되어야 한다.
 IBS 연구진은 인간 유전체 DNA에 유전자가위를 처리한 뒤, 처리 전과 후를 비교하는 절단 유전체 시퀀싱(Digenome-seq) 기법을 변형해 정확성을 파악했다. 기존에는 DNA 두 가닥 절단이 유도되어야 했기에 이번 연구에서는 한 가닥만 자르는 염기교정 가위에서도 작동할 수 있도록 특정 효소(Endo V, 이노신 특이적 절단 시약)를 추가했다. 실험 결과, 아데닌 염기교정 가위는 인간 유전체 32억 개 중 평균 60곳에만 변이를 일으키는 것을 확인할 수 있었다.
 더 나아가 연구진은 아데닌 염기교정 가위의 정확성을 높이는 방법을 다양하게 제시했다. 먼저, 교정할 염기를 찾아가는 가이드RNA 말단에 구아닌 염기를 추가해 길이를 조절하는 방식은 표적위치에서 작동 효율을 높이고, 오작동할 확률을 낮출 수 있다고 소개했다. 정확성이 높다고 알려진 Sniper 유전자가위 Sniper 유전자가위 : 3세대 크리스퍼 유전자 가위에 변이를 도입해 기존 크리스퍼 유전자가위와 표적을 자르는 활성은 유사하면서 의도하지 않는 비표적 위치의 절단은 감소를 시킴으로써 정확성을 높인 유전자가위의 일종
로 아데닌 염기교정 가위를 만들면 오작동 확률을 줄일 수 있다. 아데닌 염기교정 가위를 DNA(Plasmid DNA)에 싣지 않고 탈아미노효소와 가이드RNA를 혼합한 형태로 세포에 직접 전달하는 방식도 정확도를 향상시켜 표적위치만 자를 수 있음을 입증했다.
 연구진은 “염기교정 가위의 정확성이 입증된 만큼 앞으로 이를 활용해 단일 염기 변이를 유도하거나 교정해야 하는 유전자 및 줄기세포 치료제 개발, 고부가가치 농축산물 품종 개량 등에 널리 활용될 것으로 기대된다”고 말했다. 이번 연구는 생명공학 분야 권위 있는 학술지‘네이처 바이오테크놀로지’(Nature Biotechnology, IF 35.724) 에 3월 5일 새벽 1시(한국시간)에 게재되었다.
 IBS 유전체 교정 연구단은 2018년 4월 아데닌 염기교정 유전자가위로 동물의 특정 유전자 염기를 바꾸는데 최초로 성공해 같은 학술지에 연구성과를 게재한 바 있다.  2015년 자체 개발한 분석법(Digenome-seq)을 통해 3세대 유전자가위인 크리스퍼 Cas9과 크리스퍼 Cpf1은 물론 시토신(C)을 티민(T)으로 바꾸는 시토신 염기교정 가위의 정확성도 규명해 학계에 보고한 바 있다. (보충설명 참조)

[붙임] 1. 연구내용 2. 보충 설명 3. 그림 설명 4. 연구진 이력사항

연구 내용

논문명/저널명
Digenome-seq reveals genome-wide target specificity of CRISPR RNA-guided adenine base editors/Nature Biotechnology
저자정보
Daesik Kim#, Da-eun Kim#, Gyeorae Lee, Sung-Ik Cho, and Jin-Soo Kim*
연구내용
보충설명
2017년 최초로 보고된 아데닌 염기교정 유전자가위는 표적 DNA 염기서열에서 아데닌(A)을 구아닌(G)으로 바꿀 수 있는 기술로 아직 밝혀져야 할 부분이 많았다. 특히, 아데닌 염기교정 유전자가위의 정확성에 대해서는 알려진 것이 거의 없었다.
연구 이야기
[연구 배경] 2017년 아데닌 염기교정 유전자가위(Adenine Base Editor, ABEs)가 학계에 보고되었다. 크리스퍼 유전자가위를 변형하여 표적 DNA 염기서열에서 아데닌(A)을 구아닌(G)으로 특정 염기 한 개를 바꿀 수 있는 최신 기법이다. 많은 유전질환이 단 하나의 염기서열이 바뀌거나 고장이 나 발생하기 때문에 향후 염기교정 유전자가위는 난치성 유전질환 연구에 많은 도움이 될 것으로 생각된다. 하지만 이 기술은 기존 크리스퍼 유전자가위와 작동원리가 다르며, 아데닌 염기교정 유전자가위의 정확성이 밝혀지지 않아 앞으로의 기술 활용을 위해선 정확성을 확인하는 것이 중요하다고 생각했다.
[어려웠던 점] Digenome-seq을 진행하기 위해서는 정제된 단백질을 이용해야 하는데, 아데닌 염기교정 유전자가위의 경우 기존에 알려진 단백질 추출 방법이 없어  정제된 단백질을 추출하는데 어려움이 있었다. 여러 가지 조건으로 단백질 추출 방법을 최적화시켜 문제를 해결할 수 있었다.
[주목할 점] 이전 연구에서 크리스퍼 Cas9, 크리스퍼 Cpf1 유전자가위의 특이성을 규명하고자 개발했던 절단 유전체 시퀀싱(Digenome-seq) 기법을 응용해 전체 유전체에서 아데닌 염기교정 유전자가위의 비표적 위치를 찾는 연구를 진행했다. 그 결과 아데닌 염기교정 유전자가위의 정확성을 입증할 수 있었다. 또한, 크리스퍼 염기교정 유전자가위를 구성하는 가이드 RNA의 형태를 말단에 구아닌 염기를 추가해  길이를 조절하거나 정확성이 높다고 알려진 Sniper-유전자가위에서 착안된 Sniper-아데닌 염기교정 유전자가위를 활용하면 표적 위치에는 잘 작동하고 오작동만 줄여 그 특이성을 높일 수 있음을 확인했다.
[향후 연구계획] 아데닌 염기교정 유전자가위가 개발된 이후 동식물에 적용한 사례들이 보고되고 있다. 염기교정 유전자가위가 크리스퍼 유전자가위 기술만큼이나 널리 활용될 것으로 예상된다. 더욱 정교하게 원하는 변이를 도입할 수 있는 기술로 발전시키기 위해 크리스퍼 염기교정 유전자가위를 개발하는 일에 기여하고 싶다.

보충설명

□ 유전자가위 등장 이후, 정확성 규명/동·식물 개체 적용에 성공한 유전체 교정 연구단

CRISPR/Cas9 (크리스퍼 유전자가위)
CRISPR/Cpf1 (신형 크리스퍼 유전자가위)
작동원리
가이드RNA와 절단효소 Cas9으로 구성
Cas9이 염기서열 두 가닥을 나란히 잘라 깔끔한 단면이 남는다.
크리스퍼RNA와 절단효소 Cpf1로 구성
DNA 염기를 남겨두고 두 가닥을 얼기설기 잘라 끝이 솔기가 남는 모양이 된다.
모식도

정확성
●
Nature Methods (‘15.2.9)
●
Nature Biotechnology (‘16.6.6)
동물개체 적용
●
Genome Research (‘13.11.19)
(DNA 전달방식 없이 생쥐와 제브라피시에 유전자가위 적용 성공)
●
Nature Biotechnology (‘16.6.6)
(생쥐에 멜라닌 형성 Tyrosinase 유전자  변이를 도입해 백색증 돌연변이 제작)
식물개체 적용
●
Nature Biotechnology (‘15.1.19)
(DNA 전달방식 없이 벼, 야생담배에 유전자가위 적용 성공)
●
Nature Communications(‘17.2.16)
(대두에서 불포화 지방산 합성에 중요한 FAD2에 변이 도입성공)

Cytosine Base Editor
(시토신 염기교정 유전자가위)
Adenine Base Editor
(아데닌 염기교정 유전자가위)
작동원리
한쪽 염기가닥만 자르도록 변형된 시토신 탈아미노효소와 가이드RNA로 구성
시토신(C)을 티민(T)으로 바뀐다.
한쪽 염기가닥만 자르도록 변형된 아데닌 탈아미노효소와 가이드RNA로 구성
아데닌(A)이 구아닌(G) 바뀐다.
모식도

정확성
●
Nature Biotechnology (‘17.4.10)
●
Nature Biotechnology (‘19.2.XX)
동물개체 적용
●
Nature Biotechnology (‘17.2.27)
(Dmd 유전자(근육세포 안정적 유지),  Tyr 유전자(멜라닌 색소 형성) 생쥐서 염기 교체 성공)
●
Nature Biotechnology (‘18.4.27)
(Tyr 유전자 교체해 백색증 돌연변이 생쥐 제작, 근위축증 발병 생쥐서 Dmd 염기 교체 성공)
식물개체 적용
-
-
●
Nature Plants (‘18.6.4)
(애기장대서 FT 유전자(식물개화 조절)와 PDS3 (색소합성) 염기 교체 성공)

그림설명

[그림1] 아데닌 염기교정 가위 개념 및 작동 원리

 3세대 크리스퍼 유전자가위의 경우, 가이드 RNA(Guide RNA)가 표적 DNA에 결합하면 절단효소 Cas9이 DNA 두 가닥 모두를 절단한다. 2016년에 학계에 보고된 시토신 탈아미노효소(cytidine deaminase)가 융합된 시토신 염기교정 유전자가위(위)는 DNA 서열 중 시토신(C)만 찾아 티민(T)으로 교체할 수 있다.
 2017년 발표된 아데닌 염기교정 유전자가위(아래)는 아데닌 탈아미노효소(cytitdine deaminase)가 융합되어 서열 중 아데닌(A)만 찾아 구아닌(G)로 교체할 수 있다. 가이드 RNA가 표적 DNA에 결합하고 Cas9이 DNA의 한 가닥만 자르고 나면 그 사이에 탈아미노효소가 표적 DNA에서 아데닌(A)을 가수분해하고, DNA 복구 과정에서 이노신(I, 세포 내에서 시토신(C)과 결합)이 구아닌(G)으로 변형되는 원리다.

[그림2] 아데닌 염기교정 유전자가위 절단 유전체 시퀀싱 기법 적용 과정
 
 연구진은 아데닌 염기교정 유전자가위의 정확성을 측정하고자 절단 유전체 시퀀싱((Digenome-seq) 기법을 이용했다. 기존 절단 유전체 시퀀싱 기법은 DNA 두 가닥 절단이 유도되어야 했다. 아데닌 염기교정 가위의 경우는 한 가닥만 자르는 원리라 Endo V (Endonuclease V: 이노신 특이적 절단 시약) 효소를 사용했다. 아데닌 염기교정 가위가 DNA 한 가닥을 자르고 다른 가닥의 아데닌 (A)을 이노신 (I)으로 바꾸면, Endo V 효소가 잘리지 않은 가닥의 이노신 (I)을 절단해 DNA 두 가닥 절단 상태가 유지된다.
 연구진은 이 방법을 활용해 절단 유전체 시퀀싱 기법을 진행한 뒤, 전체 유전체 시퀀싱 기법(Whole genome sequencing)으로 아데닌 염기교정 가위의 정확성을 측정하는데 성공했다.

[그림3] 아데닌 염기교정 유전자가위의 정확성 증대 방법
 
  변형된 절단 유전체 시퀀싱(Digenome-seq) 기법을 활용해 아데닌 염기교정 유전자가위의 표적위치와 비표적위치를 찾은 이후, 정확성을 높일 수 있는 방법들을 적용했다.
 가이드 RNA의 말단에 구아닌 염기가 추가된 아데닌 염기교정 유전자 가위,  Sniper-아데닌 염기교정 유전자 가위를 기존 아데닌 염기교정 유전자 가위와 비교했다. 그 결과, 가이드 RNA의 말단에 구아닌 염기가 추가한 경우, Sniper 아데닌 염기교정 유전자 가위를 사용하였을 경우 그리고 Sniper 아데닌 염기교정 유전자 가위에 가이드 RNA의 말단에 구아닌 염기를 추가한 경우 모두 모두 정확성이 증대되는 것을 확인할 수 있었다.

연구진 이력사항

<김진수 IBS 유전체 교정 연구단, 공동 교신저자>

1. 인적사항
 ○ 소 속 : 기초과학연구원(IBS) 유전체 교정 연구단
           서울대학교 화학부
 

2. 경력사항
 ○ 1994 – 1997 : 　美 MIT/Howard Hughes Medical Institute, Associate
 ○ 1997 – 1999 : 　삼성생명과학연구소 연구책임자
 ○ 1999 – 2005 :　(주)툴젠 대표이사/연구소장
 ○ 2005 – 현재 :　서울대학교 화학부 조교수/부교수/정교수/겸임교수
 ○ 2010 – 2014 :　미래부․연구재단 지정 창의연구단장
 ○ 2014 – 현재 :　기초과학연구원 유전체 교정 연구단

3. 수상실적
 ○ 2017            제 10회 아산의학상 ‘기초의학’ 부문 수상
 ○ 2017            홍진기 창조인상
 ○ 2010            서울대 자연과학대학 연구상
 ○ 2004            교육과학기술부/과학재단 이달의 과학자상
 ○ 2001            Best Poster Award, Drug Discovery Technology

<김대식 IBS 유전체 교정 연구단 연구위원, 제1저자>

1. 인적사항
 ○ 소 속 : 서울대학교 화학부    
 

2. 경력사항
 ○ 2016 – 2018   박사 후 연구원, 서울대학교  　
 ○ 2018 – 현재   연구위원, 기초과학연구원 유전체 교정 연구단  　

3. 수상실적
 ○ 2016           아모레퍼시픽 차세대연구자상

<김다은 박사과정, 공동 제1저자>
1. 인적사항
 ○ 소  속 : 서울대학교 화학부