감염성 병원체 실시간 고감도 검출 기술 개발-5분 만에 시료 속 단일사본의 표적 DNA 증폭 판독하여 병원성 대장균 검출

감염성 병원체 실시간 고감도 검출 기술 개발-5분 만에 시료 속 단일사본의 표적 DNA 증폭 판독하여 병원성 대장균 검출

 

등록일 2021.03.09.

 

 

감염성 병원체 실시간 고감도 검출 기술 개발
5분 만에 시료 속 단일사본의 표적 DNA 증폭 판독하여
병원성 대장균 검출

 

□ 인플루엔자, 메르스, 결핵 등을 일으킬 수 있는 공기 매개 병원체든시가 독소 생성 대장균 같은 식인성 병원균이든 감염에 대항하기 위해서는 신속한 병원체 검출이 우선이다.
ㅇ 외부 침입 병원체의 존재를 알아내기 위해 시료에 포함된 핵산(유전자가 담겨있는 생체고분자) 증폭방법이 널리 사용되는 데, 장비 소형화와 다중검출에 한계가 있었다.
ㅇ 그 가운데 유전자 증폭과정을 실시간으로 모니터링 하고 증폭된 유전자에 의한 미세한 전기적 신호변화를 포착, 5분 만에 시료 내 병원성 대장균 단일사본(1 copy)의 증폭을 검출하는 기술이 소개됐다.

□ 한국연구재단(이사장 노정혜)은 재단법인 바이오나노헬스가드연구단(단장 신용범) 연구팀이 병원체의 핵산증폭반응 실시간 모니터링에 기반한 고감도 병원체 검출기술을 개발했다고 밝혔다.

□ 병원체 진단용으로 상용화된 유전자증폭장비의 경우 형광검출장비 소형화의 한계로 현장진단에 어려움이 있고, 형광 표지물질들의 파장중첩에 의해 하나의 시료에서 여러 성분을 동시에 검출하는 데 한계가 있었다.
□ 이에 별도의 표지 없이 전하를 띠는 핵산이 증폭되면서 나타나는 전기적 신호 변화를 포착하는 임피던스 센서를 이용하려는 시도가 이어지고 있었다.
ㅇ 하지만 증폭 반응용액 내 전하를 띠는 다양한 물질들로 인한 전기분극을 최소화하여 센서의 감도를 높여 증폭된 외부 유전자에 의한 신호변화를 제대로 포착해야 하는 것이 과제였다.

□ 연구팀은 나노갭 센서를 사용해 전기적 임피던스 센서의 감도를 크게 개선하였다. 나노갭 센서는 전극 분극을 감소시켜 전압강하(electric potential drop)에 의한 신호손실을 효과적으로 줄임으로써 시료 내의 미세한 전기적 신호 변화를 측정하는 감도를 50% 가량 높일 수 있다.

□ 실제 만들어진 나노갭 임피던스 센서를 기반으로 등온 유전자증폭으로 병원성 대장균 O157:H7의 표적 DNA 단일 사본의 증폭을 5분 만에 검출해냈다. 나아가 이 대장균의 단일 세포가 존재하는 시료까지 검출해냈다.

□ 기존 상용화된 유전자증폭시약을 그대로 활용하면서 복잡한 온도조절이나 형광포착을 위한 장비 없이 등온(섭씨 39도)에서 신호변화를 읽어낼 수 있음을 보여줌으로써, 병원체의 현장검출을 용이하게 하기 위한 장비 개발의 실마리가 될 것으로 기대된다.

□ 연구팀은 실용화를 위해 감도 안정화를 위한 최적 측정조건을 도출하고 현장진단을 위한 소형화 모듈 등에 대한 연구를 진행할 계획이다.

□ 과학기술정보통신부와 한국연구재단이 추진하는 글로벌프론티어사업의 지원으로 수행된 연구의 성과는 국제학술지‘바이오센서스 앤드 바이오일렉트로닉스(Biosensors and Bioelectronics)’를 통해 1월 29일 소개되었다.

주요내용 설명

<작성 : 재단법인 바이오나노헬스가드연구단 이현정 책임연구원>

논문명
Rapid and highly sensitive pathogen detection by real-time DNA monitoring using a nanogap impedimetric sensor with recombinase polymerase amplification
재조합 중합 효소 증폭하에서 나노갭 임피던스 센서 기반 실시간 DNA 증폭 모니터링에 의한 신속한 고감도 병원체 검출
저널명
바이오센서스 앤드 바이오일렉트로닉스(Biosensors and Bioelectronics)
키워드
Real-time (실시간); Pathogen detection (병원체 검출); Nanogap impedimetric sensor (나노갭 임피던스 센서); Recombinase polymerase amplification (RPA) (재조합 중합효소 증폭); Point-of-care test (POCT) (현장진단)
DOI
https://doi.org/10.1016/j.bios.2021.113042
저 자
신용범 박사(교신저자/(재)바이오나노헬스가드연구단),
이현정 박사(교신저자, 제1저자/(재)바이오나노헬스가드연구단),
이소연 박사 (제1저자/(재)바이오나노헬스가드연구단),
권정선 선임연구원 (공동저자/(재)바이오나노헬스가드연구단),
최종민 연구원 (공동저자/(재)바이오나노헬스가드연구단),
이동수 박사 (공동저자/한국과학기술연구원), 이상현 교수 (공동저자/전남대학교)

1. 연구의 필요성
ㅇ 비말이나 공기, 식인성 혹은 수인성 감염 병원체는 오랫동안 인간의 건강에 심각한 위협을 가해 왔다. 인플루엔자, 메르스, 결핵 등 공기를 통하여 전파될 수 있는 병원체로 인해, 매년 지속적인 사회적, 경제적 피해를 겪고 있으며, 2021년 현재에도 COVID19 펜데믹 상황으로 전세계가 사회적 불안감과 경제적 손실을 겪고 있는 상황이다.
ㅇ 공기 매개 병원체 이외에 시가독소 생성 대장균(STEC)은 용혈성 대장염 (HC), 용혈성 요도염 증후군(HUS) 및 혈소판 감소성 자반병 (TTP)과 같은 심각한 임상 증상을 일으키는 대표적인 식인성 병원균이다. 따라서 우리의 건강과 사회를 보호하기 위해 이러한 감염성 병원체를 신속하게 검출하는 것이 매우 중요하다.
ㅇ 병원체를 검출 및 진단하기 위한 대표적인 방법으로 중합효소 연쇄반응 (PCR)과 같은 핵산증폭반응이 사용되고 있다. 이는 시료 내 병원체의 표적 DNA를 증폭시켜 병원체를 검출하는 방식으로, 신속한 병원체 진단을 위해 병원체와 반응하는 특정 검출 프로브에 형광물질을 표지하여 표적 DNA의 증폭반응에 의해 나오는 형광신호를 분석한다.
※ 핵산(nucleic acid) : 대를 이어 전해지는 유전정보를 담고 있는 생명체에 필수 적인 생체고분자 또는 작은 생체분자로 DNA와 RNA를 모두 포함함.
ㅇ 그러나 상용화된 유전자증폭장비의 경우 형광신호 검출장비 소형화에 한계가 있어 현장진단에 어려움이 있고, 형광물질간 파장중첩으로 다중 검출에 한계가 있다.
ㅇ 이에 반해 전기적 임피던스 바이오센서는 공간적으로 분할하여 각각 전극을 탑재시킨 소형 반응챔버에 시료를 분리하여 병원체의 표적 DNA의 증폭과 동시에 각각의 전극에서 개별적인 전기적 임피던스 변화를 측정할 수 있어 장비 소형화와 다중 검출이 가능해 관련 연구가 활발히 진행되고 있다.
※ 임피던스(Impedance) : 도선에서 전기적 흐름을 방해하는 정도를 나타내는 척도
ㅇ 하지만 기존 임피던스 바이오센서는 특정 프로브를 전극에 고정시켜 생체분자들이 이에 특이적으로 결합한 후 나타나는 유효 유전상수의 변화로 인한 전기적 신호 변화를 측정하거나 전기화학적 반응에 의한 전기 신호의 변화를 분석해왔다.
ㅇ 그러나 이러한 친화도 기반 임피던스 센서는 프로브가 전극에 고정 되어야 하므로 전극은 센서로 사용되기 전 추가 전처리 공정이 필요하다. 그에 반해 본 연구에서 사용한 나노갭 센서는 친화도 기반의 전기적 센서가 아니기 때문에 전극 칩의 전처리 공정이 불필요하다.
ㅇ 또한 본 연구와 같이 친화도 기반이 아닌 비표지식 임피던스 센서에 대한 연구의 경우 보통 마이크로갭 센서를 사용하여 수 십~수 백 카피 농도의 표적 DNA 증폭을 검출하였다.
ㅇ 병원체의 표적 DNA 증폭을 위한 핵산증폭반응 용액에는 표적 DNA 이외 염 이온, 프라이머, 중합 효소 등과 같은 전하를 가진 다양한 물질들이 존재한다. 이러한 물질들은 전극 표면에 축적되어 전기 이중층을 형성하는데, 전기 이중층은 전극분극을 유발하여 센서의 감도를 감소시켜 시료의 정확한 임피던스 측정을 불가능하게 한다.
ㅇ 따라서 생물학적 시료의 미세한 전기적 특성을 고감도로 분석하기 위해서는 전극 분극의 영향을 최소화하는 것이 매우 중요하다. 이에 본 연구에서는 나노갭 센서를 제작하여 전극의 분극 현상을 감소시킴으로써 생물학적 시료의 전기적 특성 분석 시 전압 강하에 의한 신호 손실을 줄여 시료의 미세한 변화를 비표지식으로 검출할 수 있는 고감도 나노갭 임피던스 센서를 제안하였다.
ㅇ 나노갭을 갖는 전극을 적용한 임피던스 센서로 분극영향을 최소화, 검출감도를 향상시킴으로써 1개의 증폭유전자까지도 검출해냈다.
ㅇ 전극 사이의 갭을 감소시킴으로써 전극 분극을 감소시키면 두 전극 사이의 용액에 걸리는 전기적 전압강하(electric potential drop)가 줄어들어 신호 손실(signal loss)이 감소한다.
ㅇ 이에 본 연구에서는 나노갭 전극을 제작하여 임피던스 센서의 감도를 높였다. 선행연구(Biosensors and Bioelectronics 118 (2018) 153–159)에서 마이크로갭 전극과 나노갭 전극의 전기장을 시뮬레이션하여 나노갭 전극에서 전압 강하가 감소하여 나노갭 센서의 감도가 높은 것을 확인한 데 이은 후속연구결과이다.

2. 연구내용
ㅇ 본 연구에서는 병원체의 표적 DNA를 등온 핵산증폭방법 중 하나인 재조합 중합효소 증폭(RPA) 방법을 이용하여 병원체의 표적 DNA 증폭을 실시간으로 모니터링 하는 나노갭 임피던스 센서를 개발하였다.
ㅇ 재조합 중합효소 반응에서는 등온(39℃)에서 표적 DNA 증폭이 일어난다. 병원성 대장균 O157:H7 검출을 위해 100nm 간격의 대향(opposing) 금 전극으로 이루어진 나노갭 전극 칩을 재조합 반응용액에 담그고, 반응 동안 매 분마다 용액 임피던스 변화를 측정하여 표적 DNA 증폭을 확인하였다.
ㅇ 그 결과, 개발한 나노갭 임피던스 센서는 5분 만에 병원성 대장균 O157:H7의 표적 DNA 단일사본(1 카피)의 증폭을 검출하였고, 또한 병원체 용해물을 이용한 직접 RPA 하에서 병원성 대장균 O157:H7 균주의 단일 세포에서의 증폭까지 검출하였다.
ㅇ 나노갭 전극으로 전극의 분극현상을 감소시켜 신호손실을 효과적으로 줄임으로써 시료의 미세한 변화를 검출한 데 따른 것으로 생각된다.
ㅇ 실제 나노갭 전극 센서를 이용한 전기적 임피던스 거동의 세 가지 주요 인자들을 등가회로 모델을 기반으로 이론적으로 계산한 결과, DNA 증폭과 전기적 임피던스 변화 사이에 유의한 상관관계가 있음을 확인 하였다.

3. 연구성과/기대효과
ㅇ 나노갭 전극으로 전극의 분극현상을 감소시켜 생물학적 시료에 존재하는 많은 이온들로 인한 전압 강하에 따른 전기적 신호손실을 효과적으로 줄일 수 있었다.
ㅇ 개발한 나노갭 임피던스 센서를 이용함으로써 상용 분자진단 방법 및 시약을 그대로 이용하면서 복잡한 센서 표면처리 공정 없이 비표지식으로 병원체를 실시간으로 검출할 수 있을 것으로 기대된다.
ㅇ 이를 바탕으로 시료 내의 다양한 병원체를 동시에 모니터링 가능한 공간 분할형 나노갭 센서칩 기반 시스템을 제작하여 적용함으로써 현장진단 (POCT)에서 보다 간편하고 신속하게 병원체를 탐지할 수 있는 새로운 기회를 제공할 것으로 기대한다.
ㅇ 앞으로 상용화를 위해 신호잡음을 제거하고 시료의 유전자 증폭에 따른 전기적 신호 측정 감도 향상을 위한 센서 시스템 조건의 최적화와 현장진단에 적용 가능한 소형화 검출 시스템 모듈 개발에 대한 연구를 진행할 예정이다.

그림 설명

 

(그림 1) 전극 분극을 감소시킨 고감도 나노갭 임피던스 센서 기반 표적 DNA 증폭 모니터링에 의한 병원체 검출 기술 개요
나노갭 임피던스 센서를 증폭반응 용액에 넣고 표적 DNA를 증폭시키면서 매 분 마다 전기적 신호(임피던스) 변화를 측정한다. 표적 DNA가 있는 경우 유전자 증폭에 따른 미세한 전기적 신호변화가 나타나는데, 나노갭 센서의 경우 생물학적 시료에 존재하는 많은 이온들에 의한 전기분극 현상을 감소시켜 신호 변화를 정밀하게 포착 가능하다는 것이 핵심이다.
본 연구팀은 100nm 나노갭 전극을 제작하여 전극분극을 효과적으로 감소시켜 전극 사이 시료 내에서의 신호 손실을 감소시킴으로써 표적 DNA 단일 사본의 핵산증폭을 5분 만에 판독, 신속하게 병원체를 검출할 수 있었다.
출처 : 재단법인 바이오나노헬스가드연구단 이현정 책임연구원

 

 

(그림 2) (왼) 나노갭 임피던스 센서의 병원성 대장균 O157:H7의 표적 DNA 검출 성능. (오) RPA 후 표적 DNA의 증폭 여부를 확인하기 위한 전기영동 사진과 증폭된 표적 DNA 밴드의 상대적 형광 강도.
표적 DNA 농도를 변화시킨 시료를 각각 RPA로 표적 DNA를 증폭시키면서 나노갭 센서로 임피던스 변화를 측정하여 그래프로 그려본 결과,
표적 DNA가 없는 시료의 용액 임피던스 값의 변화에 비해 표적 DNA 농도가 높은 시료가 더 높은 용액 임피던스 변화값을 보였다. 이를 바탕으로 시료 내의 병원체 검출이 가능하다.
출처 : 재단법인 바이오나노헬스가드연구단 이현정 책임연구원

 

연구 이야기

<작성 : 재단법인 바이오나노헬스가드연구단 이현정 책임연구원>

□ 연구를 시작한 계기나 배경은?

전 세계가 코로나19 펜더믹 사태를 겪으면서 우리 주변의 감염성 병원체를 신속하게 실시간으로 검출하는 시스템의 필요성이 그 어느 때보다 크게 대두되었다. 본 연구단에서는 이러한 실시간 병원체 검출 시스템을 개발하기 위해 지속적으로 다양한 연구를 진행해 왔다. 이에 시료의 전기적 특성 변화를 고감도로 측정가능한 임피던스를 기반으로 하여 되도록 별도의 전처리 과정 없이 병원체를 검출 가능한 센서의 연구개발을 진행하게 되었다.

□ 이번 성과, 무엇이 다른가?

연구단에서 개발한 나노갭 임피던스 센서를 이용함으로써 상용 분자진단에 사용되는 시약과 방법 등을 변경 없이 활용하면서, 복잡한 센서의 표면처리 공정 없이도 등온으로 병원체의 표적 DNA 증폭을 모니터링하여 병원체를 실시간으로 검출할 수 있을 것으로 기대된다. 또한 본 연구의 측정 시스템에서의 등가회로 모델링을 기반으로 임피던스의 주요한 요소들을 이론적으로 계산하여 DNA 증폭과 임피던스 값의 변화가 유의한 상관관계가 있음을 증명하였다.

□ 실용화된다면 어떻게 활용될 수 있나? 실용화를 위한 과제는?

본 연구를 바탕으로 시료 내의 다양한 병원체를 동시에 모니터링할 수 있는 시스템을 제작하여 적용함으로써 현장진단에서 보다 간편하고 신속하게 병원체를 탐지할 수 있는 새로운 기회를 제공할 것으로 기대한다. 앞으로 성공적인 실용화 제품으로의 개발에 성공하기 위해서 안정적인 노이즈 신호와 시료변화에 의한 신호비율을 극대화 할 수 있는 측정 시스템 구동 조건의 확립과 현장진단에 적용 가능한 소형화 검출 시스템 모듈 개발에 대한 연구를 진행할 예정이다.